$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Preparazione del campione
- Raccogliere il sangue periferico in provette eparinizzate da 9 mL e mantenere il campione a temperatura ambiente (RT) in un rotore fino a quando non è necessario per il protocollo sperimentale.
- Etichettare le provette del citometro da 5 ml per i controlli negativi (2 provette), i controlli positivi (2 provette) e le diverse concentrazioni di allergene/farmaco (1 provetta per ogni allergene/concentrazione di farmaco testata). Posizionare le provette in un rack in cui le provette si inseriscano perfettamente senza scivolare.
- Preparare il tampone di stimolazione in acqua bidistillata contenente 2% (v/v) di HEPES, 78 mg/L di NaCl, 3,7 mg/L di KCl, 7,8 mg/L di CaCl2, 3,3 mg/L di MgCl2, 1 g/L di HSA. Regolare il pH a 7,4 e aggiungere IL-3 a 2 ng/mL. Di solito, preparare 100 mL e dividerne in aliquote da 2,5 mL da congelare a -20 °C.
- Preparare controlli positivi in PBS-Tween-20 0,05% (v/v) (PBS-T): Controllo positivo 1, N-Formil metionil-leucil-fenilalanina (fMLP) (4 μM), per confermare la qualità dei basofili; Controllo positivo 2, Anti-IgE (0,05 mg/mL) come controllo positivo IgE-mediato.
- Preparare l'allergene/farmaco in PBS-T a 2 volte la concentrazione finale desiderata.
nota: Le concentrazioni ottimali di allergeni/farmaci da utilizzare devono essere precedentemente determinate utilizzando un ampio intervallo di concentrazioni, mediante curve dose-risposta e studi di citotossicità seguendo le stesse fasi del protocollo.
2. Preparazione della miscela colorante
- Aggiungere anticorpi monoclonali marcati con fluorocromo al tampone di stimolazione dopo la concentrazione di anticorpi raccomandata dal produttore o mediante precedente titolazione degli anticorpi. In questo protocollo, aggiungiamo 1 μL di ciascun anticorpo (CCR3-APC e CD203c-PE per l'identificazione dei basofili; CD63-FITC per l'attivazione dei basofili) per 20 μL di tampone di stimolazione.
nota: Proteggere la preparazione della miscela colorante dalla luce.
- Aggiungere 23 μl di miscela colorante in ciascuna provetta.
3. Stimolazione del sangue
- Aggiungere 100 μL di PBS-T alle provette 1 e 2 (controllo negativo), 100 μL di fMLP alla provetta 3, 100 μL di anti-IgE alla provetta 4 e 100 μL delle diverse concentrazioni di allergeni/farmaci alle provette successive. Incubare per 10 minuti a 37 °C in un bagno termostatico con agitazione media per preriscaldare i reagenti.
- Aggiungere delicatamente 100 μL di sangue a ciascuna provetta per evitare l'emolisi. Agitare delicatamente le provette e incubare per 25 minuti a 37 °C in un bagno termostatico a media agitazione.
- Arrestare la degranulazione, mantenendo le provette a 4 °C per almeno 5 min.
nota: Se necessario, il protocollo può essere messo in pausa a 4 °C per 30-45 minuti.
4. Lisi eritrocitaria
- Aggiungere 2 mL di tampone di lisi 1x a ciascuna provetta per lisi gli eritrociti. Agitare ogni provetta e incubare per 5 minuti a RT.
nota: In questa fase, le cellule vengono fissate grazie agli agenti fissativi (formaldeide) contenuti nel tampone.
- Centrifugare a 300 x g a 4 °C per 5 min. Decantare il surnatante, capovolgendo la griglia in un lavandino. Le cellule rimangono sul fondo delle provette.
- Aggiungere 3 mL di PBS-T a ciascuna provetta per lavare le cellule. Agitare ogni tubo.
- Centrifugare a 300 x g a 4 °C per 5 min. Decantare il surnatante, capovolgendo la griglia in un lavandino.
nota: Conservare i campioni a 4 °C, al riparo dalla luce fino all'acquisizione con citometro a flusso.
5. Acquisizione della citometria a flusso
- Acquisizione di campioni con citometro a flusso (ad es. citometro a flusso BD FACSCalibur). Collegare il citometro a flusso al software del computer e attendere che il citometro sia pronto. Caricare il modello e le impostazioni dello strumento (Tabella 1).
- Avviare l'acquisizione del campione.
- Utilizzare le seguenti strategie citometriche per la selezione dei basofili attivati.
- Gate i linfociti dal grafico Side Scatter (SSC) - Forward Scatter (FSC).
- Eliminare i basofili dalla popolazione linfocitaria come cellule CCR3+CD203c+. Acquisisci almeno 500 basofili per provetta.
- Mostra un grafico CCR3 - CD63 per analizzare l'attivazione utilizzando CD63 come marcatore di attivazione. Impostare la soglia negativa del CD63 a circa il 2,5% utilizzando le provette di controllo negativo.
- Acquisisci tutti i campioni.
Tabella 1: Requisiti del citometro a flusso
| Sorgenti luminose (laser) | 488 nm Laser agli ioni di argon Coherent SapphireTM raffreddato ad aria; 20 mW; 633 nm JDS UniphaseTM HeNe laser raffreddato ad aria; 17 mW |
| Lunghezza d'onda eccitatoria della luce | Laser blu: 488 nm; Laser rosso: 633 nm |
| Potenza della sorgente luminosa alla lunghezza d'onda eccitatoria | Laser blu: 20 mW; Laser rosso: 17 mW |
| Filtri ottici | SSC: 488/10; FITC: 530/30, PE:585/42, APC: 660/20 |
| Rilevatori ottici | FSC, SSC, FL1-H FITC, FL2-H PE, FL4-H APC |
| Rivelatori ottici | Laser agli ioni di argon raffreddato ad aria |
| Percorsi ottici | Ottagono BD (linea laser a 488 nm); BD Trigons (linea laser a 633 nm) |