$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Preparazione degli aghi per microiniezione
- Preparare aghi per iniezione capillare in vetro a parete sottile (1,0 OD/0,75 ID) utilizzando un dispositivo di estrazione per micropipette con le seguenti impostazioni: pressione dell'aria 200, calore 502, trazione 90, velocità 80, tempo 70, tempo dell'aria all'inizio della trazione 5, tempo dell'aria alla fine della trazione 5.
- Usando una pinzetta sottile, rompere la punta dell'ago estratto in modo che l'apertura della punta abbia un diametro di circa 10 μm.
2. Preparazione delle piastre per iniezione larvale
- Sciacquare un pettine in gel con una larghezza della corsia di circa 4-5 mm in acqua sterile e lasciarlo asciugare.
- Preparare una soluzione di agarosio ad alto punto di fusione all'1,5-2% in terreno E3 e microonde fino a quando la soluzione non è limpida. Una volta raffreddato, versare un po' di agarosio in una capsula di Petri (100 x 15 mm) e agitare, aggiungendo quanto basta di agarosio per coprire completamente il fondo della pirofila.
- Una volta che lo strato di agarosio si è solidificato, posizionare sopra il pettine di gel risciacquato e asciugato in modo che l'estremità non pettinata poggi appena sopra la capsula di Petri e l'estremità pettinata tocchi l'agarosio. Assicurarsi che il pettine sia il più orizzontale possibile, creando un angolo di 30° rispetto allo strato inferiore di agarosio.
- Versare un'ulteriore piccola quantità di agarosio all'interfaccia tra il pettine e lo strato inferiore di agarosio in modo che lo strato di agarosio fresco copra i pozzetti del favo. Lasciar raffreddare completamente prima di rimuovere il pettine. Utilizzando la punta di una pipetta, rimuovere eventuali pezzi di agarosio sporgenti dai pozzetti.
- Versare il terreno E3 sopra lo stampo a iniezione e conservare a 4 °C.
- Prima di ogni utilizzo, sostituire con un mezzo fresco e rampe di iniezione calde a 28,5 °C per almeno un'ora prima dell'iniezione.
- Immediatamente prima delle iniezioni, sostituire l'E3 sulla rampa di iniezione con un terreno E3 contenente 200 μg/ml di etil-3-amminobenzoato (tricaina).
3. Preparazione dell'inoculo di Streptococcus iniae (S. iniae)
- Preparare e sterilizzare in autoclave il brodo Todd Hewitt con lo 0,2% di estratto di lievito e il 2% di peptone proteoso (THY+P): 30 g/L di Todd Hewitt, 2 g/L di estratto di lievito, 20 g/L di peptone proteoso. Per le piastre di agar, aggiungere 14 g/L di agar.
- Preparare le colture batteriche la sera prima delle infezioni pipettando un'aliquota di 100 μl di brodo batterico congelato in 10 ml di brodo THY+P in una provetta sigillata da 15 ml. Incubare per una notte senza agitazione a 37 °C. Dopo 14-16 ore di crescita, utilizzare la coltura notturna per fare scorte di congelamento o prepararsi per l'uso nelle iniezioni.
- Preparare le scorte di congelamento mettendo 1 ml di coltura notturna in 500 μl di glicerolo all'80% in una provetta da centrifuga da 1,7 ml. Per evitare cicli di congelamento-scongelamento, preparare 100 μl di aliquote monouso da questa miscela e conservarle a -80 °C.
- Per S. iniae utilizzato nelle infezioni, diluire la coltura notturna 1:100 per un volume totale di 10 ml di coltura aggiungendo 0,1 ml di coltura notturna a 9,9 ml di brodo THY+P. Crescere a 37 °C senza agitazione per circa 4-5 ore. Monitora la densità ottica (OD) a 600 nm utilizzando uno spettrofotometro Nanodrop e raccogli i batteri in una fase medio-logaritmica quando l'OD600 nm raggiunge 0,250-0,500. Un OD600 nm di 0,250 corrisponde a circa 108 unità formanti colonie (CFU)/ml.
- Pellettare 1 ml di coltura batterica in una provetta da centrifuga da 1,7 ml a 1.500 x g per 5 min. Risospendere in 1 ml di soluzione salina fresca tamponata con fosfato (PBS) e ripetere. Misurare il diametro esterno di 600 nm dei batteri in PBS, pellet e risospensione in PBS per ottenere la concentrazione desiderata.
- Per facilitare la visualizzazione della microiniezione, aggiungere rosso fenolo alle sospensioni batteriche prima dell'iniezione per una concentrazione finale dello 0,1%.
- Per gli esperimenti che comportano l'iniezione di batteri uccisi dal calore, riscaldare i batteri in PBS a 95 °C per 30 minuti. Confermare che il processo di uccisione del calore ha ridotto il numero di batteri vitali a livelli non rilevabili impiattando un volume di iniezione (circa 1 nl) su piastre di agar solido THY+P e incubando per una notte a 37 °C.
4. Etichettatura di S. iniae con un colorante fluorescente rosso CellTracker
- Per marcare le cellule batteriche viventi, preparare una soluzione madre di un colorante fluorescente CellTracker o equivalente. Poiché il colorante utilizzato è disponibile in aliquote di polvere da 20 x 50 μg e deve essere risospeso in dimetilsolfossido (DMSO), aggiungere 7,3 μl di DMSO alla provetta per ottenere una concentrazione madre di 10 mM.
- Testare un intervallo di concentrazioni di colorante (ad es. 0,5-25 μM) sui batteri per determinare la concentrazione ottimale più bassa che colora le cellule. Le celle che si dividono rapidamente e gli esperimenti più lunghi possono richiedere una maggiore concentrazione di colorante.
- Pellet 1,0 ml di coltura batterica in una provetta da 1,7 ml mediante centrifugazione come descritto sopra (sezione 3). Risospendere il pellet in 1 ml di PBS fresco e aggiungere il volume appropriato di colorante alla coltura batterica.
- Incubare senza agitazione a 37 °C per 30 minuti. Centrifugare i batteri e risospendere in 1 ml di brodo THY+P preriscaldato e incubare senza agitazione per altri 30 minuti a 37 °C.
- Centrifugare i batteri e lavarli due volte in PBS prima di misurare l'OD600 nm e diluire i batteri per microiniezione come descritto sopra (sezione 3). In genere iniettiamo circa 100 CFU in 1 nl di volume di iniezione per i nostri studi sul reclutamento dei leucociti e sulla fagocitosi.
5. Preparazione delle larve di pesce zebra per le infezioni
- Prepara le coppie riproduttive la sera prima e raccogli gli embrioni come descritto da Rosen et al.Incubare gli embrioni in terreno E3 a 28,5 °C fino al momento dell'infezione.
- Per il pesce zebra che verrà ripreso, prevenire lo sviluppo di pigmento (melanizzazione) aggiungendo N-feniltiourea (PTU) al terreno E3 a 24 ore dopo la fecondazione (hpf) per una concentrazione finale di 0,2 nM.
- Per le infezioni che coinvolgono embrioni di età pari o superiore a 2 giorni dalla fecondazione (dpf), dechorionate gli embrioni manualmente con un paio di pinzette sottili. In alternativa, dechorionato gli embrioni rimuovendo l'E3 e sostituendoli con la pronasi (2 mg/ml) per circa 5 minuti o fino a quando un pipettaggio delicato non rompe gli embrioni dal corion. La maggior parte delle larve dovrebbe essersi schiusa naturalmente entro 3 dpf.
- Anestetizzare il pesce zebra alcuni minuti prima dell'infezione inserendo larve decorionate in un terreno E3 contenente 200 μg/ml di tricaina.
6. Iniezione di vescicole otiche di S. iniae in larve di tre giorni
- Accendere il microiniettore e impostare l'intervallo di tempo su "millisecondi". Aprire la valvola sul serbatoio dell'anidride carbonica per far entrare il gas nella linea. La pressione del microiniettore dovrebbe essere di circa 20 libbre per pollice quadrato (PSI). Regolare la pressione nell'unità microiniettore ruotando in senso orario la manopola zigrinata nera per aumentare la pressione o in senso antiorario per diminuire la pressione.
- Agitare la coltura di S. iniae preparata in rosso fenolo e PBS e utilizzare una punta per microloader per caricare 2-3 μl di coltura in un ago per iniezione capillare tirato.
- Montare l'ago caricato su un micromanipolatore collegato a un supporto magnetico e posizionarlo sotto uno stereomicroscopio in modo che l'ago si trovi a un angolo di circa 45-65° rispetto alla base del microscopio.
- Premere il pedale del microiniettore per erogare una goccia di inoculo sulla punta dell'ago. Misurare il diametro della goccia utilizzando la barra della scala nella lente oculare del microscopio.
- In alternativa, stimare il diametro della goccia iniettando un volume in una goccia di olio minerale su un vetrino da microscopio con una barra graduata. Il diametro della goccia dovrebbe essere di circa 0,10 mm, che è un volume di circa 1 nl.
- Regola la dimensione della goccia regolando l'impostazione della durata sul microiniettore o tagliando una parte maggiore della punta dell'ago con una pinzetta sottile. Si noti che il tempo di iniezione dovrebbe essere compreso tra 20 e 35 msec per evitare di causare troppi danni ai tessuti.
- Utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica, trasferire 12 larve anestetizzate in ciascun pozzetto dello stampo ad iniezione.
- Usa un'asta di vetro, un anello per capelli o una punta di plastica per posizionare delicatamente le larve in modo che le teste siano rivolte verso la parte posteriore del microscopio e le sacche vitellino siano contro il lato sinistro del pozzetto. Punta l'orecchio sinistro della larva verso il soffitto.
- Guardando attraverso la lente oculare dello stereomicroscopio, utilizzare le manopole sul micromanipolatore per allineare l'ago caricato con la vescicola otica in modo che entrambi si trovino nello stesso campo visivo. Forare lo strato epiteliale esterno della vescicola otica con la punta dell'ago in modo che la punta dell'ago si trovi appena all'interno della vescicola.
- Premere sul pedale per iniettare 1 nl della dose desiderata di S. iniae. Assicurarsi di utilizzare una pressione sufficientemente bassa per non rompere la cavità. Se l'iniezione ha successo, la vescicola otica, ma non il tessuto circostante, deve riempirsi con l'inoculo rosso fenolo (Figura 1 Ai). Rimuovere immediatamente qualsiasi pesce iniettato erroneamente dalla piastra di iniezione.
- Ritrarre con cautela l'ago dalla larva e spostare manualmente la piastra di iniezione in modo che la larva successiva sia in vista. Fallo con ingrandimento 5X.
nota: La retrazione dell'ago può provocare la deposizione di alcuni batteri al di fuori della vescicola otica, che può distorcere la sopravvivenza e i risultati del reclutamento dei leucociti. Per evitare ciò, si consiglia di iniettare batteri marcati con coloranti fluorescenti e di scansionare visivamente le larve iniettate al microscopio a fluorescenza per rimuovere eventuali larve in cui ciò si è verificato. Una larva correttamente iniettata è mostrata in (Figura 1 Bi).
- Per garantire che il volume di iniezione/inoculo rimanga lo stesso nel corso dell'esperimento, iniettare una goccia della sospensione batterica in una provetta da centrifuga da 1,7 ml contenente 100 μl di PBS sterile ogni 48° embrione. Piastra i 100 μl su piastre di agar THY+P a 37 °C per una notte per determinare le CFU nel volume di iniezione.
- Quando l'intero gruppo di 12 larve sulla rampa di iniezione è stato iniettato, utilizzare con cautela una pipetta di plastica per il trasferimento per rimuovere le larve dai pozzetti e metterle in una nuova capsula di Petri (35 x 10 mm2). Rimuovere la soluzione di tricaina e sostituirla con circa 2 ml di terreno E3 fresco per consentire alle larve di riprendersi.
- Pipet ha iniettato le larve in pozzetti singoli di una piastra a 96 pozzetti e le ha incubate a 28,5 °C. Monitorare le larve nel tempo per verificarne la sopravvivenza in queste piastre o rimuoverle in un secondo momento per l'imaging o la conta delle UFC.
7. Fissazione delle larve per l'imaging
- Fissare le larve in una soluzione ghiacciata di paraformaldeide al 4% in PBS come descritto nel paragrafo 7.
- A temperatura ambiente, lavare 3 volte per 5 minuti ciascuna in PBS prima dell'imaging.
8. Preparazione delle larve per l'imaging dal vivo
- Preparare una soluzione di agarosio a basso punto di fusione all'1,5% in E3 riscaldandola nel microonde fino a quando la soluzione non sarà limpida.
- Mettere la soluzione di agarosio a bagnomaria a 55 °C per farla raffreddare ma non indurire.
- Aggiungere la tricaina all'agarosio fino a una concentrazione finale dello 0,016%.
- Utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica, posizionare 4-5 larve anestetizzate in un piatto con fondo di vetro sul tavolino di uno stereomicroscopio.
- Togliere la soluzione di tricaina e agarosio dal bagnomaria a 55 °C e lasciarla raffreddare a temperatura ambiente per 1-2 minuti. Mentre l'agarosio si sta raffreddando, rimuovere quanto più liquido possibile dalle larve anestetizzate.
- Versare l'agarosio raffreddato nella pirofila fino a coprire circa metà della superficie. Agitare il piatto per spalmare l'agarosio. Si noti che se l'agarosio è troppo caldo, ucciderà le larve. Inoltre, se viene aggiunto troppo agarosio al piatto, la lente dell'obiettivo del microscopio potrebbe colpire il fondo del piatto durante la messa a fuoco attraverso l'agarosio.
- Usando una pipetta di trasferimento, raccogli le larve che hanno galleggiato ai lati del piatto e pipettale di nuovo al centro.
- Sotto lo stereomicroscopio, posizionare delicatamente le larve come desiderato con un anello per capelli, una lunga punta di pipetta o un'asta di vetro. Per l'imaging della vescicola otica, posizionare le larve in modo che la vescicola otica sinistra sia piatta contro il fondo della piastra.
- Lasciate raffreddare l'agarosio per circa 10 minuti prima di spostare il piatto. Le larve possono cambiare posizione se l'agarosio non è solido. Pipettare delicatamente un po' di tricaina e una soluzione E3 sulla parte superiore dello strato di agarosio per mantenerlo umido.
9. Imaging confocale dell'infezione
- Posizionare il piatto di vetro con le larve sul tavolino di un microscopio invertito con un sistema confocale a scansione laser FV-1000.
- Impostare il foro stenopeico su 200-300 μm e utilizzando una lente dell'obiettivo con apertura numerica 0,75/20X, impostare z-stack con fette da 3-6 μm.
- Utilizzare la scansione a linea continua per regolare la potenza del laser e il guadagno del rivelatore per ciascun canale.
- Utilizzando la scansione sequenziale della linea per ciascun canale di fluorescenza (ad esempio, 488 e 543 nm) e il contrasto di interferenza differenziale (DIC), condurre un filmato time-lapse della vescicola otica sinistra ogni 3 minuti per 2-6 ore per osservare il reclutamento iniziale e la fagocitosi da parte di neutrofili e macrofagi. Per cicli di tempo più lunghi, mettere un coperchio sulla capsula di Petri per evitare l'evaporazione e l'essiccazione dell'agarosio.
- Acquisire immagini fisse di larve fisse (Figura 1B) o vive (Figura 2) con ingrandimento 20X o 40X.
10. Fotoconversione di leucociti marcati con Dendra2 alla vescicola otica
NOTA: Dendra2 può essere fotoconvertito dalla fluorescenza verde a quella rossa focalizzando un laser a 405 nm (il 50-70% della potenza del laser dovrebbe essere sufficiente) sulla regione di interesse (ROI) per 1 minuto. Di seguito è riportato il protocollo passo-passo utilizzato per il sistema confocale a scansione laser FV-1000:
- Visualizzare il campione utilizzando una scansione z-stack con i laser a 488 nm e 543 nm. Utilizzare la scansione a linea continua per regolare la potenza del laser e il guadagno del rivelatore. Verificare che non vi sia fluorescenza rossa fotoconvertita accidentalmente.
- Nella finestra "Controllo acquisizione immagini", in "Impostazioni stimolo" selezionare lo strumento "Usa scanner" e scegliere "Principale". Seleziona il laser a 405 nm e impostalo al 70% di potenza. Utilizzando l'opzione cerchio, definire la ROI nella vescicola otica.
- In "Impostazione inizio stimolo" selezionare "Attivazione in serie" con una preattivazione di 1 fotogramma e un tempo di attivazione di 60.000 msec. Nella finestra "Impostazioni di acquisizione" sotto l'intestazione "Scansione tempo", scegliere 2 intervalli di 00:01:00 (uno per la pre- e uno per la post-fotoconversione).
nota: Dopo che la scansione della serie time-lapse è completa, il Dendra2 dovrebbe essere stato fotoconvertito al suo stato di fluorescenza rossa.
- Scansiona il campione con uno z-stack utilizzando i laser a 488 nm e 543 nm per visualizzare la fluorescenza rossa fotoconvertita e l'eventuale fluorescenza verde rimanente (Figura 3).
