1. Citometria a flusso e ordinamento dei sottotipi di linfociti
NOTA: Ordinare i linfociti in base al tipo di cellula è essenziale per stabilire le etichette del tipo di cellula di base (cioè corrette) per addestrare e testare un classificatore di tipo di cellula nell'apprendimento supervisionato. La citometria a flusso, un metodo gold standard, viene utilizzata per identificare e separare i linfociti.
- Preparare una miscela di anticorpi di colorazione dei marcatori di superficie in 100 μL di terreno RPMI-1640 fresco [con il 10% di FBS, 0,1 μg di CD3e (17A2), CD8a (53-6,7), CD19 (1D3), CD45R (B220, RA3-6B2) e NK1.1 (PK136)] e 0,25 μg di anticorpi CD4 (GK1.5) per colpire i linfociti T B, CD4+ T e CD8+.
- Aggiungere 100 μl della miscela di anticorpi alla sospensione cellulare.
- Incubare per 25 minuti con ghiaccio.
- Lavare le cellule aggiungendo 5 mL di PBS e centrifugare a 400 x g per 5 minuti a 4 °C, due volte.
- Risospendere il pellet cellulare in 5 mL di terreno RPMI-1640 fresco con il 10% di FBS e 2,5 μg di DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindo).
- Raccogliere ciascun tipo di linfociti separatamente con la citometria a flusso utilizzando i livelli di fluorescenza dei marcatori sopra descritti. Escludere contemporaneamente le celle morte utilizzando i segnali DAPI.
2. 3D Imaging di Fase Quantitativo
- Mantenere i linfociti ordinati sul ghiaccio durante le procedure di imaging, che dovrebbero essere completate entro 5 ore (dall'isolamento dei linfociti dal topo) per evitare danni cellulari e alterazioni biochimiche.
- Selezionare un tipo di cellula selezionata (tra linfociti B, CD4+ T e CD8+ T) e diluire il campione a 180 cellule/μL con terreno RPMI per ottenere condizioni di imaging ottimali (ad esempio, una cellula per singolo campo visivo).
- Caricare 120 μl del campione diluito in una camera di imaging mediante iniezione lenta. Controllare accuratamente la presenza di bolle nella camera di imaging con il campione. Se ci sono delle bolle, rimuovile con cura, in quanto comprometterebbero la qualità delle misurazioni.
- Acquisisci tomogrammi RI 3D utilizzando un microscopio di fase quantitativa 3D commerciale, o olotomografia, e il suo software di imaging.
NOTA: Informazioni dettagliate sulla configurazione sperimentale possono essere trovate nel manoscritto originale.
- Posizionare una goccia di acqua distillata sopra la lente dell'obiettivo del microscopio.
- Posizionare la camera di imaging con il campione sul tavolino di traslazione del microscopio e regolarne la posizione in modo che il campione sia allineato con la lente dell'obiettivo.
- Regolare le posizioni assiali dell'obiettivo e delle lenti del condensatore facendo clic rispettivamente su Messa a fuoco e Superficie nella scheda "Calibrazione" della prospettiva "Microscopio" del software di imaging.
- Allineare le lenti dell'obiettivo e del condensatore facendo clic su Modalità automatica. In alternativa, utilizzare la modalità di scansione e regolare manualmente le lenti in modo che i modelli di illuminazione siano localizzati nella regione centrale del campo visivo.
- Torna alla modalità normale e regola la fase di traslazione per individuare una cella nel campo visivo.
- Trova il piano focale regolando la posizione assiale della lente dell'obiettivo. La perfetta messa a fuoco rende quasi invisibile il bordo del campione visualizzato sullo schermo.
- Regola la fase di traduzione per trovare una posizione senza cella.
- Fare clic su Calibra per misurare più ologrammi 2D con angoli di illuminazione variabili.
- Regola la fase di traslazione per individuare una cella al centro del campo visivo.
- Passare alla scheda "Acquisizione" e fare clic su Istantanea 3D per misurare gli ologrammi della cella con angoli di illuminazione identici a quelli del passaggio 2.4.8.
- Quando i dati acquisiti vengono presentati nel pannello "Gestione dati", fare clic con il pulsante destro del mouse sui dati acquisiti e fare clic su Elabora per ricostruire un tomogramma RI 3D dagli ologrammi misurati nei passaggi 2.4.8 e 2.4.10, utilizzando l'algoritmo di tomografia a diffrazione implementato nel software di imaging.
- Ripetere i passaggi 2.4.5-2.4.11 per misurare più di 100 celle e garantire la potenza statistica per l'apprendimento automatico.
- Tutte le immagini elaborate attraverso il passaggio 2.4.11. possono essere visualizzate. Nel pannello "Gestione dati", fare clic con il pulsante destro del mouse sui dati e fare clic su Apri per visualizzare i dati. Fare clic su Tomogramma RI nel pannello "Gestione dati". Nella scheda "Preset", fare clic su Carica e fare doppio clic su "lymphocyte.xml", che è una funzione di trasferimento predefinita fornita dal software di imaging per visualizzare il tomogramma in base alle distribuzioni RI 3D.
- Ripetere i passaggi 2.2-2.4 per misurare i tomogrammi RI 3D di tutti i sottotipi di linfociti.
