Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto
1. Prelievo di sangue dai pazienti
ATTENZIONE: Adottare adeguate misure di sicurezza di laboratorio quando si raccoglie sangue intero dal paziente. Indossare guanti e occhiali. Se il paziente è in isolamento, seguire le procedure di biosicurezza di livello 4.
- Per prelevare sangue intero per via endovenosa dal paziente, utilizzare un ago a farfalla con tubo di prolunga di piccolo diametro e un tubo a vuoto per la raccolta del sangue contenente un tampone di lisi/legante. Appoggiare il braccio del paziente in posizione abbassata e posizionare la provetta di raccolta più in basso dell'ago a farfalla. Inserire l'ago a farfalla nella vena del paziente e collegare il tubo a vuoto per la raccolta del sangue alla prolunga di piccolo diametro.
nota: Ciò impedirà il riflusso.
- Dopo il prelievo di sangue, mescolare il contenuto della provetta capovolgendo la provetta 5 - 10 volte.
nota: A causa del vuoto rimanente nella provetta per la raccolta del sangue contenente 1,6 mL di tampone di lisi/legante, il volume del campione raccolto sarà automaticamente di 1,6 mL.
- Disinfettare l'esterno del tubo con etanolo al 70%.
- Incubare le provette per 20 minuti a temperatura ambiente.
nota: Il protocollo può essere messo in pausa e le provette per il prelievo di sangue completo possono essere conservate a -20 °C, 5 °C, 25 °C o 37 °C per almeno 1 mese.
- Continuare direttamente con il metodo di estrazione NA semplificato.
2. Estrazione NA semplificata del sangue intero
- Per purificare NA dal sangue raccolto inattivato dal tampone di lisi/legante, mescolare il contenuto della provetta capovolgendo manualmente la provetta a vuoto 5 - 10 volte.
- Rimuovere con cautela il coperchio del tubo e scaricare il coperchio.
- Versare l'aliquota preparata di MGP (1 mL) direttamente nella provetta per il prelievo del sangue.
- Posizionare un nuovo coperchio di una provetta per la raccolta del sangue non utilizzata sulla provetta contenente il campione.
- Posizionare un dito sul coperchio per assicurarsi che la provetta sia ben chiusa e mescolare il contenuto della provetta capovolgendo manualmente la provetta per la raccolta del sangue 5 - 10 volte.
- Posizionare il tubo nel supporto magnetico e tenere un dito sul coperchio per assicurarsi che il tubo sia ben chiuso.
- Capovolgere il supporto magnetico con il tubo alcune volte a mano per assicurarsi che tutti gli MGP siano raccolti sul lato del tubo con il magnete.
nota: Il supporto magnetico può essere sostituito con un magnete allungato e un elastico.
- Rimuovere il coperchio della provetta ed eliminare il contenuto della provetta utilizzando una pipetta monouso o semplicemente versando il contenuto in una provetta di raccolta da 50 ml.
nota: Evitare la formazione di aerosol dalla provetta di raccolta da 50 ml chiudendo la provetta con un coperchio.
- Versare l'aliquota preparata del tampone di lavaggio-1 (WB-1, 4 mL) direttamente nella provetta per il prelievo del sangue.
- Posizionare il coperchio sul tubo e posizionare un dito sul coperchio per assicurarsi che il tubo sia ben chiuso.
- Rimuovere il tubo dal supporto magnetico, mantenendo il coperchio ben serrato con un dito.
nota: Se si utilizza un magnete e un elastico, è sufficiente rimuovere l'elastico e il magnete dal tubo.
- Risospendere gli MGP capovolgendo manualmente la provetta per la raccolta del sangue 5 - 10 volte.
- Ripetere i passaggi 2.6 - 2.8.
- Versare l'aliquota preparata di WB-2 (1,5 mL) direttamente nella provetta per il prelievo del sangue.
- Posizionare il coperchio sul tubo e rimuovere il tubo dal supporto magnetico.
nota: Se si utilizza un magnete e un elastico, è sufficiente rimuovere l'elastico e il magnete dal tubo.
- Metti un dito sul coperchio per assicurarti che il tubo sia ben chiuso.
- Risospendere gli MGP capovolgendo manualmente la provetta per la raccolta del sangue per alcuni secondi.
- Ripetere i passaggi 2.6 - 2.8.
- Versare l'aliquota preparata di WB-3 (3 mL) direttamente nella provetta per il prelievo del sangue.
- Posizionare il coperchio sul tubo e rimuovere il tubo dal supporto magnetico.
nota: Se si utilizza un magnete e un elastico, è sufficiente rimuovere l'elastico e il magnete dal tubo.
- Metti un dito sul coperchio per assicurarti che il tubo sia ben chiuso.
- Risospendere gli MGP capovolgendo manualmente la provetta per la raccolta del sangue 5 - 10 volte.
- Ripetere i passaggi 2.6 - 2.8.
- Versare l'aliquota preparata del tampone di eluizione (EB, 100 μL) direttamente nella provetta per il prelievo del sangue.
- Posizionare il coperchio sul tubo e rimuovere il tubo dal supporto magnetico.
nota: Se si utilizza un magnete e un elastico, è sufficiente rimuovere l'elastico e il magnete dal tubo.
- Risospendere gli MGP nell'EB picchiettando la provetta per la raccolta del sangue 5 - 10 volte con un dito.
nota: Il protocollo può essere messo in pausa e le provette possono essere conservate a -20 °C.
- Trasferire una goccia (5 - 8 μL) degli MGP risospesi nella miscela di reazione di amplificazione NA a valle utilizzando una pipetta monouso da 1,5 mL (può essere utilizzato qualsiasi saggio diagnostico di amplificazione NA a valle, come i test di amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP)/LAMP a trascrizione inversa (RT-LAMP) o la reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR)/RT-qPCR).
nota: Gli NA si attaccheranno agli MGP, quindi assicurati di utilizzare gli MGP nella reazione di amplificazione degli NA a valle. Miscelare le sospensioni MGP prima dell'uso. Dopo la miscelazione, gli MGP si raccoglieranno sul fondo del tubo.
