Imaging a super-risoluzione della formazione di sinapsi immunologiche delle cellule NK su un doppio strato lipidico supportato

Abstract

Fonte: Zheng, P., et al. Imaging a super risoluzione della sinapsi immunologica delle cellule natural killer su un doppio strato lipidico planare supportato da vetro. J. Vis. Exp. (2015).

Questo video mostra una tecnica per visualizzare la formazione della sinapsi immunologica nelle cellule natural killer (NK) su un doppio strato lipidico supportato (SLB). L'SLB viene prima marcato con un ligando del recettore attivante delle cellule NK marcato con fluoroforo, seguito dall'incubazione con cellule NK. Successivamente, le cellule vengono colorate per l'actina polimerizzata e i granuli litici perforin-positivi. Questo approccio consente la visualizzazione della formazione delle sinapsi utilizzando la microscopia STED (Stimulated Emission Depletion).

Protocollo

1. Preparazione dei liposomi

1. Calcolare la quantità di soluzioni madre sospese di cloroformio di 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) e 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-cap biotinile (Biotina-PE) per ottenere stock diluiti alla concentrazione finale desiderata. Per ottenere le concentrazioni finali di 400 μM di DOPC e 80 μM di fosfolipidi di Biotina-PE a 10 ml ciascuno, iniziare inserendo 629 μl di 10 mg/ml di DOPC e 88 μl di 10 mg/ml di Biotin-PE in provette di vetro separate.
   NOTA: è importante pulire le siringhe Hamilton in vetro e le provette per cromatografia in vetro con una soluzione detergente (1 L di etanolo al 95% in 120 ml di acqua contenente 60 g di idrossido di potassio, KOH) durante il trasferimento della soluzione madre in sospensione di cloroformio di DOPC e Biotina-PE.
2. Asciugare il cloroformio con un getto di argon nella cappa chimica. Sigillare la provetta per cromatografia con parafilm.
3. Sottoporre i liposomi appena essiccati a un alto vuoto in un liofilizzatore per una notte (O/N) per rimuovere eventuali residui di cloroformio. Per il completamento in giornata, asciugare per 60-90 minuti.
4. Mentre il liofilizzatore è in funzione, preparare un tampone di diluizione. Per questo protocollo, preparare 25 ml costituiti da 25 mM di Tris, pH 8.0; 150 mM di NaCl; e il 2% (in peso) di detergente n-ottil-β-D-glucopiranoside (OG). Mescola prima i primi due ingredienti, quindi sposta l'ossigeno con l'argon prima di aggiungere la polvere OG secca. Dopo la preparazione, filtrare la soluzione OG con membrana in acetato di cellulosa da 0,2 micron e conservare a 4°C.
5. Inoltre, preparare due flaconi con tappo a vite da 1 L di tampone tris-salino alle stesse concentrazioni, ma senza OG. Posizionare un'ancoretta magnetica pulita con acqua distillata sul fondo di ciascuna. Preparare altri 6 litri di tampone salino Tris. Togliete l'ossigeno da tutte le bombole con l'argon e mettetele a 4°C.
6. Dopo la liofilizzazione, sciogliere i lipidi essiccati nel tampone Tris-salino OG per ottenere una soluzione di 4 mM di ciascuno. Seguendo i volumi dell'esempio, aggiungere 2 ml alla provetta DOPC e 0,2 ml alla provetta Biotin-PE.
7. Mescolare i lipidi biotina-PE con i lipidi DOPC. Ciò migliora la mobilità dell'SLB, poiché la biotina accoppiata può compromettere la fluidità dei gruppi della testa del fosfato. Per ottenere una concentrazione finale di 80 μM di Biotina-PE, miscelare 0,2 ml di 4 mM di Biotina-PE e 1 ml di 4 mM di DOPC. Quindi aggiungere 8,8 ml di tampone Tris-salino OG.
8. Per una concentrazione finale di 400 μM DOPC, è sufficiente miscelare 1 ml di 4 mM DOPC con 9 ml di Tris-salina OG.
9. Riempire il sonicatore con acqua ghiacciata. Mettere il tubo di vetro contenente il fosfolipide diluito al centro del sonicatore utilizzando un morsetto di servizio. Sonicare il fosfolipide diluito per 10 minuti fino a quando la soluzione diventa limpida.
   nota: Aggiungere del ghiaccio nel bagnomaria del sonicatore per mantenere bassa la temperatura poiché la sonicazione genererà calore.
10. Riempire le provette con argon per spostare l'ossigeno nell'aria del liquido e sigillarle con parafilm.

2. Dialisi dei liposomi

1. Tagliare dal rotolo due sezioni di tubo per dialisi a secco (taglio del peso molecolare: 12-14.000, diametro: 6,4 mm) di lunghezza appropriata (in questo esempio, 40 cm), una per ogni diluizione di fosfolipidi.
2. Reidratare le sezioni del tubo lasciandole in ammollo in 200 ml di acqua distillata in un becher di vetro per 2 minuti.
3. Scaldalo nel microonde per 5 minuti a una temperatura alta, o almeno fino a quando l'acqua non arriva a ebollizione.
4. Fare un nodo a un'estremità di ogni tubo e risciacquare l'interno con alcuni millilitri di tampone Tris-saline-OG. Successivamente, spremere meticolosamente la maggior parte possibile di questo tampone di lavaggio per ridurre al minimo la quantità di tampone rimanente all'interno.
5. In una cappa a flusso laminare, aggiungere i fosfolipidi diluiti in ciascuna provetta e bloccare le estremità aperte con una piccola chiusura della provetta per dialisi in modo da escludere tutta l'aria. L'esclusione completa dell'aria richiederà il sacrificio di un piccolo volume del campione mediante serraggio al di sotto della "linea di galleggiamento".
6. Immergere i campioni nelle bottiglie precedentemente preparate di tampone tris-salino senza OG. Spostare l'ossigeno nella bottiglia con l'argon prima di richiuderla e mettere ad agitare O/N a 4°C.
7. Trasferire il tubo in un nuovo flacone di tampone tris-salino senza OG ogni 12 ore per almeno 3 volte.
8. Poco prima della rimozione dei lipidi dializzati, preparare una serie di tubicini in cui aliquotare i lipidi riempiendo ciascuno di argon per spostare l'ossigeno.
9. Dopo 36 ore, portare i flaconi per dialisi nella cappa a flusso laminare e rimuovere i tubi per dialisi dai flaconi. Tieni a portata di mano un pannolino o un bicchiere da banco per raccogliere il deflusso umido.
10. Tagliare il tubo per dialisi sopra la clip, quindi rimuovere la clip e trasferire con cura la soluzione lipidica dialitizzata tramite pipetta in aliquote da 1 ml in provette pre-preparate riempite con gas argon su ghiaccio.
11. Aliquotare la soluzione acquosa di liposomi e utilizzare il flusso di argon per spostare nuovamente l'ossigeno in ogni tubo.
12. Conservare i liposomi a 4°C. Non congelare.

3. Isolare e Coltivare Cellule NK Umane

1. Aliquotare 15 ml di sangue periferico o buffy coat in una provetta conica da 50 ml. Diluire questo sangue con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente l'1% di siero fetale bovino (FBS) in un rapporto di 1:1.
2. Aggiungere delicatamente 13 ml di Ficoll sul fondo della provetta con una pipetta sierologica da 10 ml.
3. Centrifugare questa provetta per 20 minuti a 1.200 x g con l'acceleratore e il freno o alle impostazioni più basse.
4. Dopo la centrifugazione, utilizzare una pipetta sierologica per raccogliere lo strato intermedio bianco torbido galleggiante delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC), che dovrebbe trovarsi e l'intersezione tra uno strato superiore giallo chiaro e uno strato inferiore di colore pallido più torbido, entrambi situati sopra uno strato più basso di globuli rossi (RBC). NOTA: Non raccogliere globuli rossi durante la raccolta dei PBMC.
5. Collocare le PBMC raccolte in una nuova provetta conica da 50 ml e diluirle fino alla capacità con PBS contenente l'1% di FBS. Centrifugare nuovamente, questa volta con il freno e l'acceleratore al massimo, per 5 min a 300 x g.
6. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 10 ml di PBS contenente l'1% di FBS.
7. Contare le celle durante la centrifugazione ancora una volta con le stesse impostazioni del passaggio 3.6.
8. Scartare nuovamente il surnatante e risospendere le cellule in terreno R10 a una densità di 10 milioni di cellule/ml.
9. Prendi 30 milioni di cellule in una provetta di polistirene da 5 ml e isola le cellule NK utilizzando un kit di separazione magnetica, seguendo le istruzioni del produttore. Dopo l'isolamento, contare le cellule un'altra e risospendere a una densità di 500.000 cellule/ml in terreno completo R10 (88% terreno del Roswell Park Memorial Institute, RPMI; 10% FBS; 1% acido N-2-idrossietilpiperazina-N-2-etano solfonico, HEPES; 1% piruvato di sodio) integrato con IL-2 (100 U/ml). Coltura a 37° in incubatore a CO₂ e sostituzione del terreno 2-3 volte a settimana.

4. Assemblaggio del doppio strato lipidico planare supportato da vetro

1. Preparare 100 ml di soluzione piranha mescolando perossido di idrogeno al 30% con acido solforico in un rapporto di 1:3 in un becher.
   nota: Eseguire sempre lavori con agenti nocivi come l'acido solforico in una cappa chimica adeguatamente designata.
2. In questa soluzione, immergere 2 vetrini coprioggetti rettangolari #1.5 in soluzione piranha per 20-30 min.
   nota: È essenziale pulire i vetrini coprioggetti con una soluzione piranha.
3. Durante la pulizia dei vetrini, prelevare 1 provetta di lipidi DOPC da 400 μM precedentemente preparati e 1 provetta di lipidi Biotin-PE da 80 μM precedentemente preparati. Trasportali sul ghiaccio al serbatoio dell'argon.
4. Spostare l'ossigeno in una nuova provetta da microcentrifuga con argon, quindi aggiungere il DOPC e la biotina-PE in un rapporto 1:1. Il volume specifico varierà in base alle esigenze sperimentali, ma dovrebbe essere di almeno 2 μl ciascuno. Spostare nuovamente l'ossigeno nella provetta della miscela con il gas argon e le singole provette dei reagenti, prima di rimettere queste ultime in frigorifero.
5. Al termine della pulizia, sciacquare accuratamente i vetrini coprioggetti con acqua distillata. Metti i vetrini coprioggetti ad asciugare all'aria per alcuni minuti.
6. Prelevare 1,5 μl della miscela di liposomi preparata al punto 5.4 e aliquotarla in un'unica goccia in una delle camere della corsia del vetrino. L'uso di 2 drop per corsia è tipico, ma non necessario.
7. Posizionare in modo rapido ed efficiente il vetrino coprioggetti asciutto sulle goccioline. Assicurarsi che le gocce siano sufficientemente distanziate in modo che non si uniscano una volta posizionato il vetrino coprioggetti. Inoltre, assicurarsi che le gocce rimangano circolari e ben definite, senza toccare i bordi delle pareti della camera. Premere con decisione tra e intorno a ciascuna corsia per garantire una tenuta stagna tra il vetrino coprioggetti e il vetrino.
8. Segna le posizioni delle gocce usando un pennarello.
9. Passare 100 μl di caseina acquosa al 5% attraverso la camera per bloccare il doppio strato. Cercare di assicurarsi che non ci siano bolle nella camera di flusso.
10. Iniettare 100 μl di streptavidina a una concentrazione di 333 ng/ml in ciascuna corsia. Incubare per 10-15 minuti a temperatura ambiente (RT). Successivamente, lavare facendo scorrere 3 ml di soluzione salina tamponata HEPES (HBS)/albumina sierica umana all'1% (HSA) attraverso ciascuna corsia per rimuovere la streptavidina in eccesso.
11. Aggiungere 100 μl di anti-CD16 biotinilato marcato con fluorescenza come Alexa Fluor 568 alla concentrazione proteica precedentemente determinata come più efficace. Incubare al buio per 20-30 minuti. Lavare nuovamente facendo scorrere 3 ml di HBS/1% HSA su ciascuna corsia.
12. Far fluire 100 μl di D-biotina ad una concentrazione di 25 nM attraverso la camera per legare l'eventuale streptavidina in eccesso ed eliminare così la possibilità di legame non specifico della streptavidina alle cellule.
13. Contare le cellule NK e risospendere a una concentrazione di 500.000/ml in HBS/1% HSA.
14. Mentre si fanno girare le cellule, lavare la D-biotina fuori dalla camera con altri 3 ml di HBS/1% HSA per corsia.
15. Controllare la mobilità dei ligandi sull'SLB mediante recupero a fluorescenza dopo fotosbiancamento (recupero a fluorescenza dopo fotosbiancamento, FRAP) su una microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) o confocale prima di aggiungere cellule NK.
16. Una volta che le celle hanno finito di girare e sono state risospese alla concentrazione desiderata, aggiungere 100 μl a ciascuna corsia.
17. Posizionare la camera in un'incubatrice a 37° 5% CO₂ per 30-60 minuti.
18. Dopo questo periodo di incubazione, fissare le cellule con paraformaldeide al 4% a RT per 10-20 minuti. Lavare facendo scorrere 3 ml di PBS attraverso ogni corsia per rimuovere la paraformaldeide.
19. Aggiungere 400 μl di tampone bloccante (5% di siero d'asino normale e 0,2% di Triton X-100 in PBS). Incubare a RT per 30 min.
20. Colorare la F-actina e la perforina aggiungendo 200 μl di falloidina diluita marcata con fluorescenza (1 unità/ml di falloidina marcata) e anticorpo monoclonale anti-perforina marcato con fluorescenza (500 ng/ml di anticorpo monoclonale anti-perforina). Incubare a RT per 1 ora.
21. Lavare facendo scorrere 3 ml di PBS. La camera è pronta per l'imaging.

5. Imaging della sinapsi NK su Lipid Bilayer utilizzando STED

1. Attiva tutti i moduli hardware necessari.
2. Avviare il software di analisi delle immagini. Abilita sia la scansione risonante che i moduli STED. Dopo aver effettuato queste selezioni, attendere circa 3-5 minuti per l'avvio del software.
3. Fare clic sulla scheda "Configurazione" nella parte superiore dello schermo.
4. Selezionare "Laser Config", quindi accendere la luce bianca e i laser STED 592 nm.
5. Scegli l'obiettivo 100x e allinea il raggio laser di eccitazione con il laser a svuotamento da 592 nm.
6. Selezionare il modulo "Laser Config", spegnere il laser di esaurimento 592 e accendere il laser di esaurimento 660 nm.
7. Posizionare il vetrino sul tavolino, sopra l'obiettivo. Mettere a fuoco le cellule legate sulla regione delimitata del doppio strato utilizzando la lampada a luce bianca e gli oculari.
8. Torna alla scheda "Acquisizione", direttamente a destra della scheda "Configurazione".
9. Fare clic sulla scheda "Passa a luce bianca", quindi accendere il modulo e trascinare la linea laser di eccitazione sulla lunghezza d'onda appropriata.
10. Selezionare il rivelatore desiderato dall'elenco di quelli disponibili, quindi impostare l'intervallo di rilevamento in modo che includa l'intervallo appropriato di lunghezze d'onda.
    nota: NON posizionare MAI il campo di rilevamento direttamente sotto il raggio di eccitazione.
11. Fare clic sul pulsante "Sequenziale" nella barra degli strumenti "Acquisisci" a sinistra per visualizzare la finestra di dialogo Scansione sequenziale nella parte inferiore della barra degli strumenti a sinistra. Ciò consente all'utente di aggiungere più sequenze, ognuna con un raggio di eccitazione diverso per un colore diverso. Fare clic su "Tra i fotogrammi", quindi impostare la frequenza di eccitazione, il rilevatore e l'intervallo di rilevamento per ogni colore aggiuntivo come nei passaggi 5.9 e 5.10.
12. Una volta ottimizzate tutte le impostazioni, premi "Avvia" per iniziare il processo di acquisizione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfocolina	Avanti	Codice 850375C	Preparazione dei liposomi
Tappo in biotinile 18:1 PE 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-(cap biotinyl) (sale sodico)	Avanti	Codice 870273C	Preparazione dei liposomi
Gas argon, compresso	Aria gas	UN1006	Preparazione dei liposomi
Un liofilizzante	Labconco	Zona libera 7740020	Preparazione dei liposomi
Tubi per liofilizzatori	Labconco	Codice 7540200	Preparazione dei liposomi
Colonne per cromatografia	Santa Cruz	SC-205558	Preparazione dei liposomi
1 M Tris pH 8.0	Ambion	AM9856	Preparazione dei liposomi
5 M NaCl	Ambion	AM9759	Preparazione dei liposomi
Ottil-β-D-glucopiranoside	Sigma-Aldrich	O1008	Preparazione dei liposomi
Tubi per dialisi	Laboratori dello spettro	132676	Preparazione dei liposomi
Piastra in polistirene con fondo a V a 96 pozzetti (non trattata)	Corning	3896	Determinazione della densità degli anticorpi
Perle di silice non funzionalizzate	Laboratori Bangs	SS06N	Determinazione della densità degli anticorpi
Tubi FACS	Fisher Scientifico	14-959-2A	Determinazione della densità degli anticorpi
Perline QuantumTM MESF	Laboratori Bangs	variabile	Determinazione della densità degli anticorpi
caseina	Sigma-Aldrich	Codice: C0875	Preparazione del doppio strato lipidico
Soluzione salina tamponata HEPES + 1% HSA	casereccio		Preparazione del doppio strato lipidico
Streptavidina	Tecnologie di vita	434301	Preparazione del doppio strato lipidico
Proteina biotinilata marcata in fluorescenza	casereccio		Preparazione del doppio strato lipidico
ibidi Sticky-Slide VI 0.4	ibidi	Codice 80608	Preparazione del doppio strato lipidico
Vetrino coprioggetti in vetro 25x75 mm	ibidi	Codice 10812	Preparazione del doppio strato lipidico
Perossido di idrogeno (30%)	Fisher Scientic	BP2633	Preparazione del doppio strato lipidico
acido solforico	Sigma-Aldrich	258105	Preparazione del doppio strato lipidico
D-Biotina	Invitrogen	B20656	Preparazione del doppio strato lipidico
Carta per lenti	VWR	Codice: 54826-001	Per l'imaging
Olio da immersione di tipo F	Leica	11 513 859	Per l'imaging
Un microscopio Leica TCS STED	Leica		Per l'imaging