$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Preparazione dei controlli
- Trasferire quanto segue in provette da 1,5 ml separate e adeguatamente etichettate:
- Aggiungere 500 μl di cellule K562 risospese con IMDM contenente DiO risospeso nella provetta da 1,5 mL marcata "Doppio positivo".
- Aggiungere 500 μl di cellule K562 risolute con IMDM contenente DiO risospeso nella provetta da 1,5 mL marcata "solo DiO".
- Aggiungere 500 μL di IMDM fresco contenente cellule K562 non marcate in sospensione nella provetta da 1,5 mL marcata "Solo ioduro di propidio (PI)".
- Immergere le provette doppio positivo e solo PI a bagnomaria a 55 °C per 5 minuti.
- Trascorsi i 5 minuti, rimuovere i tubi e pulirli con etanolo al 70%.
- Aggiungere 10 L di PI al doppio positivo e PI solo 1,5 mL di provette.
- Posizionare tutti e tre i controlli delle cellule target K562 nell'incubatore a 37 °C per 30 minuti.
- Al termine dell'incubazione di 30 minuti, centrifugare tutti e tre i controlli delle cellule bersaglio K562 per 2 minuti a 163 x g.
- Rimuovere con cautela il surnatante senza disturbare il pellet cellulare.
- Risospendere ciascun controllo con 20 μL di terreno di coltura cellulare IMDM fresco e lasciarlo nell'incubatore a 37 °C con CO2 al 5% per almeno 30 minuti per un segnale DiO ottimale.
nota: I controlli sono ora pronti per essere eseguiti attraverso il citometro a flusso per immagini.
2. Preparazione del campione del saggio di citotossicità
- Preparare ed etichettare di conseguenza le provette da 1,5 ml per ogni campione/partecipante.
- La pipetta desiderava il rapporto tra le cellule NK e le cellule K562 marcate con DiO in ciascuna provetta.
NOTA: Ad esempio, il rapporto desiderato tra le cellule bersaglio K562 e le cellule effettrici NK è 1:5.
- Centrifugare per 5 min a 135 x g.
- Rimuovere con cautela il surnatante senza disturbare il pellet cellulare.
- Risospendere la miscela di cellule K562 marcate con NK-DiO in 500 μL di terreno cellulare NK senza interleuchina-2 (IL-2) e 2-mercaptoetanolo (2-ME) (terreno di coltura cellulare NK incompleto).
NOTA: Il terreno di coltura cellulare NK incompleto è Minimum Essential Medium Eagle con bicarbonato di sodio, senza L-glutammina, ribonucleosidi e desossiribonucleosidi.
- Aggiungere 5 μl di PI a ciascuna provetta.
- Centrifugare per 2 min a 163 x g.
- Incubare le cellule a 37 °C per 2 ore.
- Dopo 2 ore di incubazione, centrifugare per 2 minuti a 163 x g.
- Rimuovere con cautela il surnatante senza disturbare il pellet cellulare.
- Risospendere le cellule in terreni di coltura cellulare NK incompleti da 25 μl.
3. Preparazione del campione spontaneo ("S")
- Pipettare 500 μl di cellule K562 marcate con DiO (concentrazione di 1 x 106 cellule/mL) in una provetta da 1,5 mL.
- Aggiungere 10 μl di PI a ciascuna provetta.
- Provetta da centrifuga per 2 minuti a 163 x g.
- Incubare le cellule a 37 °C per 2 ore.
- Dopo 2 ore di incubazione, centrifugare per 2 minuti a 163 x g.
- Rimuovere con cautela il surnatante senza disturbare il pellet cellulare.
- Risospendere le cellule in 25 μl di terreno di coltura cellulare alfa-minimo essenziale (α-MEM) incompleto.
4. Acquisizione dati con citometro a flusso per imaging
- Premere il pulsante verde all'interno dello sportello anteriore del citometro a flusso per immagini per accendere lo strumento.
- Accendere tutti i computer associati al citometro a flusso per immagini.
- Avviare il software del citometro a flusso per immagini.
- Fare clic sul pulsante "Avvio" per lavare il sistema e preparare la linea di campionamento.
- Una volta completato l'"Avvio", chiudere la finestra "Calibrazioni".
- Assegna canali: in alto a sinistra, fai clic su ciascun canale per assegnarli.
- Sul lato destro, fai clic sul pulsante del grafico a dispersione per creare 4 grafici a dispersione: Raw Max Pixel _MC_6 vs Area_M06, Raw Max Pixel _MC_2 vs Area_M02, Raw Max Pixel _MC_5 vs Area_M05 e FieldArea_M01 vs AspectRatio_M01.
- Iniziare l'analisi dei campioni utilizzando prima il controllo "Doppio positivo".
- Fare clic su "Carica".
- Posizionare la provetta da 1,5 ml con il campione "Doppio positivo" dei passaggi da 1.4 a 1.8 nel caricatore di campioni.
- Seleziona l'obiettivo 40X nella scheda "Ingrandimento".
- Accendere i laser da 405 mW e 642 mW.
- Attiva il canale "Brightfield".
- Fare clic su "Seleziona intensità".
- Sulla base del campione di controllo "Doppio positivo", determinare l'intensità desiderata per il laser da 405 mW in modo che il rivelatore non sia sovraccaricato.
nota: Ad esempio, l'intensità ottimale per questo esperimento è stata fissata a 11 mW.
- Dopo aver ottenuto la configurazione desiderata, acquisire i dati.
- Nella scheda "Acquisizione file", inserisci un testo personalizzato per il nome del file. Selezionare una cartella per il salvataggio dei file di dati.
- Inserisci il numero di celle da acquisire accanto a "Raccogli". In genere questo numero varia tra 1.000 e 10.000.
- Clicca su "Acquisisci."
NOTA: Una volta acquisito il numero di celle desiderato, il file di dati viene salvato automaticamente nella cartella precedentemente selezionata.
- Al termine dell'acquisizione, caricare il campione di controllo successivo: solo controllo DiO.
- Fare clic su "Carica".
- Posizionare la provetta da 1,5 mL con il campione "DiO only" nel caricatore di campioni.
- Lascia selezionato l'obiettivo 40X nella scheda "Ingrandimento".
- Lasciare acceso il laser da 405 mW.
- Spegnere il laser da 642 mW e il canale "Brightfield".
NOTA: Ora che è stata raggiunta la configurazione desiderata, è possibile acquisire i dati.
- Nella scheda "Acquisizione file", inserisci un testo personalizzato per il nome del file e seleziona una cartella per il salvataggio dei file di dati. Inserisci il numero di celle da acquisire accanto a "Raccogli". In genere questo numero è 1.000.
- Clicca su "Acquisisci."
nota: Una volta acquisito il numero di celle desiderato, il file di dati viene salvato automaticamente nella cartella precedentemente selezionata.
- Ripetere il passaggio 4.10 per il campione di controllo "solo PI". I campioni sperimentali sono ora pronti per essere raccolti.
- Gestire i campioni sperimentali rimanenti, compresi i "campioni spontanei 'S'" come segue:
- Lascia selezionato l'obiettivo 40X nella scheda "Ingrandimento".
- Accendere i laser da 405 mW e 642 mW.
- Attiva il canale "Brightfield".
- Fare clic su "Imposta intensità".
- Nella scheda "Acquisizione file", inserisci un testo personalizzato per il nome del file e seleziona una cartella per il salvataggio dei file di dati. Inserisci un testo per il nome del file personalizzato.
- Inserisci il numero di celle da acquisire accanto a "Raccogli".
- Fare clic sul pulsante "Acquisisci".
nota: Una volta acquisito il numero di celle desiderato, il file di dati viene salvato automaticamente nella cartella precedentemente selezionata.
- Ripetere il passaggio 4.12 per tutti i campioni sperimentali.
- Dopo che tutti i dati e i file sperimentali sono stati raccolti, fare clic sul pulsante "Spegni" per sterilizzare il sistema.
5. Analisi del campione del citometro a flusso per imaging
- Aprire l'applicazione software di analisi del citometro a flusso per immagini.
- Nella sezione "File", apri un esperimento. RIF.
- Costruisci una nuova matrice utilizzando un singolo colore. RIF (controllo solo DiO e controllo solo PI, creati durante i passaggi 4.10 e 4.11) selezionando "Crea una nuova matrice" nella scheda Compensazione del software del citometro a flusso per immagini.
NOTA: Il software richiederà la selezione dei singoli file di colore e li unirà per creare un file matrice (estensione .ctm), che deve essere selezionato per applicare la compensazione del canale.
- Crea grafici a punti utilizzando la funzione "blocchi predefiniti" del software.
- Crea un dot-plot (BrightFieldGradient_RMS vs frequenza) per il gate delle celle focalizzate. Richiamare il cancello "Focus" (Figura 1A).
- Utilizzando il gate "Focus", creare un grafico a punti dell'area del campo luminoso rispetto al rapporto di aspetto del campo chiaro per bloccare le celle singoletto. Chiamare il cancello "Single" (Figura 1B).
- Utilizzando il gate "Single", creare un grafico a punti di Intensity_MC_Ch02 rispetto a Intensity_MC_Ch5. Utilizzare questo grafico per identificare e controllare le celle solo DiO-positive (target, vive) e le celle PI-DiO double-positive (target, morte) (Figura 1C).
nota: Tutti i grafici descritti nei passaggi 5.4.1, 5.4.2 e 5.4.3 possono essere creati utilizzando la funzione "blocchi predefiniti" del software.
- Fare clic sulla funzione statistica del grafico a punti per accedere ai numeri di cella di ciascun cancello.
- Calcolare la percentuale di bersagli morti nel campione spontaneo e nei campioni sperimentali utilizzando la seguente formula:
% bersagli morti nel campione = (#dead bersagli x 100)/(#live bersagli + #dead bersagli)
- Calcolare la citotossicità utilizzando la seguente formula:
% citotossicità = [(Morto sperimentale-Morto spontaneo)/(100-Morto spontaneo)]x100
