Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Preparazione generale di PCLS umani e successiva esposizione a sostanze chimiche
NOTA: Sono necessarie due persone per riempire un polmone. Si raccomanda un libretto di vaccinazione aggiornato per l'epatite A e B. I pazienti vengono sottoposti a screening di routine per l'HCV e l'HIV prima del trapianto di polmone. Se viene diagnosticata o sospettata un'infezione attiva da Mycobacterium tuberculosis, il polmone deve essere respinto. Tuttavia, tutto il tessuto polmonare umano fresco e i campioni da esso derivati devono essere trattati come potenzialmente infettivi e devono essere adottate le relative misure di protezione (maschere con filtro antiparticolato (FFP2), occhiali protettivi, guanti) per garantire la sicurezza sul lavoro del personale. La procedura dura 60 - 90 minuti.
- Confermare l'integrità del lobo polmonare umano.
nota: Una lacerazione nella pleura impedisce il riempimento omogeneo del tessuto. Il materiale polmonare umano deve essere del giorno della resezione. Sono tollerati periodi di conservazione di circa 2 ore a temperatura ambiente (RT) prima di riempirlo con agarosio su ghiaccio. Il tessuto che utilizziamo in questo protocollo è ottenuto da pazienti sottoposti a resezione. Non proviene da pazienti deceduti. Se il fazzoletto è stato conservato su ghiaccio, preriscaldarlo a RT prima di riempirlo, altrimenti l'agarosio polimerizzerà immediatamente e non sarà possibile un riempimento omogeneo><.
cautela: Assicurarsi che tutte le persone a contatto con materiale umano autoctono indossino indumenti protettivi costituiti da un camice da laboratorio, due paia di guanti, un berretto, una maschera facciale e un paio di occhiali di sicurezza. Il materiale umano è potenzialmente infettivo.
- Pesare 7,5 g di agarosio a basso gelificamento e aggiungerlo a 250 ml di acqua bidistillata. Far bollire l'agarosio nel microonde fino a quando l'agarosio non si sarà sciolto. Raffreddarlo a circa 40 °C, a seconda del punto di fusione e gelificazione dell'agarosio.
nota: Sono necessari diversi flaconi, a seconda delle dimensioni del lobo.
- Preriscaldare e mantenere il terreno di coltura (Tabella dei materiali) a 37 °C.
nota: Se l'agarosio è troppo caldo, le vitamine nel terreno di coltura perderanno efficacia e le cellule saranno danneggiate. Se la temperatura del terreno/soluzione di agarosio è inferiore a 37 °C, il processo di gelificazione inizierà e comprometterà il riempimento omogeneo del polmone. Si consiglia solo un intervallo di temperatura compreso tra 37 °C e 39 °C.
- Prima di iniziare, mettere a portata di mano tutti i materiali necessari: 5 - 10 pinze, un catetere flessibile di circa 1 m di lunghezza, una siringa adatta (ad es. 50 mL) che adatta la connessione al catetere e una ghiacciaia piena di ghiaccio.
- Incannulare la trachea/bronco principale inserendo il tubo di silicone e fissandolo con una pinza orientata parallelamente al tubo, in modo che la pinza stringa il tessuto insieme al tubo di silicone senza pizzicarlo. Verificare che il tubo di silicone sia fissato all'interno e non possa scivolare fuori durante la procedura di riempimento. Chiudere tutti gli altri bronchi, vasi sanguigni e lesioni con morsetti, in modo che non possa fuoriuscire agarosio durante la procedura di riempimento.
- Miscelare un volume equivalente di agarosio a bassa gelificazione al 3% con il terreno di coltura in un becher. Instillare la miscela nel polmone utilizzando una siringa da 50 ml. Prima di riempire nuovamente la siringa con il fluido, chiudere il catetere con le dita o con una pinza per evitare bolle d'aria e reflusso di agarosio. Riempi il lobo polmonare fino a quando non è completamente gonfiato. Toccare con cura la pleura polmonare sul lato; La pleura dovrebbe essere uniforme e dura.
nota: A seconda delle dimensioni del lobo polmonare, possono essere necessari fino a 2 o 3 L di agarosio/soluzione media.
- Ripetere i passaggi 1,5 - 1,6 per ogni bronco nel caso di più bronchi all'interno di un singolo campione.
- Mettere il polmone in ghiaccio per la polimerizzazione dell'agarosio in gel per 20 - 40 minuti, a seconda della quantità di agarosio instillato. Toccare con cura la pleura su più lati per verificare se è dura e fredda, indicando che la polimerizzazione è completa, altrimenti continuare ad aspettare. Lascia che i patologi taglino il polmone a fette, prelevino i loro campioni e conservino il materiale polmonare sul ghiaccio per il trasporto.
- Tagliare il tessuto polmonare umano in lastre di 3 - 5 cm con un coltello affilato.
nota: Usa una nuova lama per ogni polmone per garantire l'affilatura.
- Riempire l'affettatrice con 400 ml di soluzione salina bilanciata di Earle (EBSS) ghiacciata. Tagliare immediatamente i nuclei cilindrici di tessuto dalle lastre polmonari utilizzando un cacciavite semiautomatico con uno strumento di carotaggio del diametro preferito (ad esempio, 8 mm; 10 mm).
nota: Questo diametro deve essere equivalente al diametro del portafazzoletti all'interno della macchina.
- Regolare lo spessore delle fette polmonari al valore di spessore desiderato.
nota: Uno spessore di circa 250 μm è comunemente usato negli esperimenti PCLS. Il produttore dell'affettatrice per tessuti consiglia il proprio misuratore di spessore della fetta di tessuto per la verifica dello spessore della fetta. In alternativa, è possibile utilizzare la colorazione a montaggio intero combinata con la microscopia confocale per determinare lo spessore della fetta.
- Trasferire i nuclei di tessuto nel supporto per fazzoletti dell'affettatrice. Metti il peso (parte del supporto del tessuto) sopra l'anima del tessuto. Impostare la velocità del braccio e la velocità della lama su 6 sull'affettatrice. Inizia ad affettare il nucleo del tessuto in PCLS.
- Integratore 500 ml di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) disponibile in commercio: Miscela di nutrienti F-12 DMEM/F12 (1:1) con 5 ml di penicillina (10.000 unità/mL) e streptomicina (10.000 μg/mL). Conservare il terreno di coltura per diversi giorni in condizioni sterili in frigorifero. Preriscaldare solo il volume richiesto del medio.
nota: La penicillina sarà inattivata se mantenuta a 37 °C per periodi più lunghi. Utilizzare terreni di coltura privi di siero e coloranti, poiché la composizione del siero varia da lotto a lotto e i coloranti, come il rosso fenolo, possono interferire con i saggi.
- Riempire una piastra di Petri (100 x 15 mm) con 25 ml di terreno di coltura ghiacciato. Il terreno deve essere drenato dall'affettatrice in un becher aprendo la fascetta del cilindro di vetro. Trasferire le fette da un becher nella piastra di Petri con terreno di coltura utilizzando un applicatore (ad esempio, ansa di inoculazione). Mettere la piastra di Petri in un'incubatrice (37 °C, 5% CO2, 100% di umidità). Lasciare riscaldare il fluido prima delle fasi di lavaggio.
nota: Tutti gli ulteriori passaggi vengono eseguiti in condizioni sterili.
- Metti un colino nella piastra di Petri per lavare il PCLS. Rimuovere completamente il terreno di coltura con una pipetta sierologica da 10 mL attraverso il filtro cellulare e aggiungere 25 mL di terreno fresco preriscaldato a 37 °C. Ripetere questo passaggio 3 - 4 volte ogni 30 min.
nota: Il filtro cellulare impedisce che le fette vengano aspirate nella pipetta, per evitare danni alle fette.
- Trasferire con cura le fette di polmone in una piastra di coltura a 24 pozzetti con un minimo di 500 μL di terreno di coltura per due fette per pozzetto.
nota: Per il trasferimento, utilizzare preferibilmente un anello di inoculazione e lasciare che le fette galleggino sul passante per evitare danni ai tessuti. Non è necessaria un'ulteriore separazione delle fette, poiché solo una carenza di terreno fresco sufficiente indurrà la morte cellulare nelle fette di tessuto. Le fette possono sovrapporsi o toccarsi nel pozzetto: questo non ha alcuna influenza sulla vitalità del tessuto.
