Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Preparazione generale di fette di polmone umano tagliate con precisione (PCLS) e successiva esposizione a sostanze chimiche
NOTA: Sono necessarie due persone per riempire un polmone. Si raccomanda un libretto di vaccinazione aggiornato per l'epatite A e B. Prima del trapianto di polmone, i pazienti vengono sottoposti a screening di routine per il virus dell'epatite C (HCV) e il virus dell'immunodeficienza umana (HIV). Se viene diagnosticata o sospettata un'infezione attiva da Mycobacterium tuberculosis, il polmone deve essere respinto. Tuttavia, tutto il tessuto polmonare umano fresco e i campioni da esso derivati devono essere trattati come potenzialmente infettivi e devono essere adottate le relative misure di protezione (maschere con filtro antiparticolato (FFP2), occhiali protettivi, guanti) per garantire la sicurezza sul lavoro del personale. La procedura dura 60 - 90 minuti.
- Confermare l'integrità del lobo polmonare umano.
nota: Una lacerazione nella pleura impedisce il riempimento omogeneo del tessuto. Il materiale polmonare umano deve essere del giorno della resezione. Sono tollerati periodi di conservazione di circa 2 ore a temperatura ambiente (RT) prima di riempirlo con agarosio su ghiaccio. Il tessuto che utilizziamo in questo protocollo è ottenuto da pazienti sottoposti a resezione. Non proviene da pazienti deceduti. Se il fazzoletto è stato conservato su ghiaccio, preriscaldarlo a RT prima di riempirlo, altrimenti l'agarosio polimerizzerà immediatamente e non sarà possibile un riempimento omogeneo.
cautela: Assicurarsi che tutte le persone a contatto con materiale umano autoctono indossino indumenti protettivi costituiti da un camice da laboratorio, due paia di guanti, un berretto, una maschera facciale e un paio di occhiali di sicurezza. Il materiale umano è potenzialmente infettivo.
- Pesare 7,5 g di agarosio a basso gelificamento e aggiungerlo a 250 ml di acqua bidistillata. Far bollire l'agarosio nel microonde fino a quando l'agarosio non si sarà sciolto. Raffreddarlo a circa 40 °C, a seconda del punto di fusione e gelificazione dell'agarosio.
nota: Sono necessari diversi flaconi, a seconda delle dimensioni del lobo.
- Preriscaldare e mantenere il terreno di coltura (Tabella dei materiali) a 37 °C.
nota: Se l'agarosio è troppo caldo, le vitamine nel terreno di coltura perderanno efficacia e le cellule saranno danneggiate. Se la temperatura del terreno/soluzione di agarosio è inferiore a 37 °C, il processo di gelificazione inizierà e comprometterà il riempimento omogeneo del polmone. Si consiglia solo un intervallo di temperatura compreso tra 37 °C e 39 °C.
- Prima di iniziare, mettere a portata di mano tutti i materiali necessari: 5 - 10 pinze, un catetere flessibile di circa 1 m di lunghezza, una siringa adatta (ad es. 50 mL) che adatta la connessione al catetere e una ghiacciaia piena di ghiaccio.
- Incannulare la trachea/bronco principale inserendo il tubo di silicone e fissandolo con una pinza orientata parallelamente al tubo, in modo che la pinza stringa il tessuto insieme al tubo di silicone senza pizzicarlo. Verificare che il tubo di silicone sia fissato all'interno e non possa scivolare fuori durante la procedura di riempimento. Chiudere tutti gli altri bronchi, vasi sanguigni e lesioni con morsetti, in modo che non possa fuoriuscire agarosio durante la procedura di riempimento.
- Miscelare un volume equivalente di agarosio a bassa gelificazione al 3% con il terreno di coltura in un becher. Instillare la miscela nel polmone utilizzando una siringa da 50 ml. Prima di riempire nuovamente la siringa con il fluido, chiudere il catetere con le dita o con una pinza per evitare bolle d'aria e reflusso di agarosio. Riempi il lobo polmonare fino a quando non è completamente gonfiato. Toccare con cura la pleura polmonare sul lato; La pleura dovrebbe essere uniforme e dura.
nota: A seconda delle dimensioni del lobo polmonare, possono essere necessari fino a 2 o 3 L di agarosio/soluzione media.
- Ripetere i passaggi 1,5 - 1,6 per ogni bronco nel caso di più bronchi all'interno di un singolo campione.
- Mettere il polmone in ghiaccio per la polimerizzazione dell'agarosio in gel per 20 - 40 minuti, a seconda della quantità di agarosio instillato. Toccare con cura la pleura su più lati per verificare se è dura e fredda, indicando che la polimerizzazione è completa, altrimenti continuare ad aspettare. I patologi taglieranno il polmone a fette, preleveranno i loro campioni e conserveranno il materiale polmonare sul ghiaccio per il trasporto.
- Tagliare il tessuto polmonare umano in lastre di 3 - 5 cm con un coltello affilato.
nota: Usa una nuova lama per ogni polmone per garantire l'affilatura.
- Riempire l'affettatrice con 400 ml di soluzione salina bilanciata di Earle (EBSS) ghiacciata. Tagliare immediatamente i nuclei cilindrici di tessuto dalle lastre polmonari utilizzando un cacciavite semiautomatico con uno strumento di carotaggio del diametro preferito (ad esempio, 8 mm; 10 mm).
nota: Questo diametro deve essere equivalente al diametro del portafazzoletti all'interno della macchina.
- Regolare lo spessore delle fette polmonari al valore di spessore desiderato.
nota: Uno spessore di circa 250 μm è comunemente usato negli esperimenti PCLS. Il produttore dell'affettatrice per tessuti consiglia il proprio misuratore di spessore della fetta di tessuto per la verifica dello spessore della fetta. In alternativa, la colorazione a montaggio intero combinata con la microscopia confocale può essere utilizzata per determinare lo spessore della fetta come descritto da Brismar et al.
- Trasferire i nuclei di tessuto nel supporto per fazzoletti dell'affettatrice. Metti il peso (parte del supporto del tessuto) sopra l'anima del tessuto. Impostare la velocità del braccio e la velocità della lama su 6 sull'affettatrice. Inizia ad affettare il nucleo del tessuto in PCLS.
- Integratore 500 ml di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) disponibile in commercio: Miscela di nutrienti F-12 DMEM/F12 (1:1) con 5 ml di penicillina (10.000 unità/mL) e streptomicina (10.000 μg/mL). Conservare il terreno di coltura per diversi giorni in condizioni sterili in frigorifero. Preriscaldare solo il volume richiesto del fluido.
nota: La penicillina sarà inattivata se mantenuta a 37 °C per periodi più lunghi. Utilizzare terreni di coltura privi di siero e coloranti, poiché la composizione del siero varia da lotto a lotto e i coloranti, come il rosso fenolo, possono interferire con i saggi.
- Riempire una piastra di Petri (100 x 15 mm) con 25 ml di terreno di coltura ghiacciato. Il terreno deve essere drenato dall'affettatrice in un becher aprendo la fascetta del cilindro di vetro. Trasferire le fette da un becher nella piastra di Petri con terreno di coltura utilizzando un applicatore (ad esempio, ansa di inoculazione). Mettere la piastra di Petri in un'incubatrice (37 °C, 5% CO2, 100% di umidità). Lasciare riscaldare il fluido prima delle fasi di lavaggio.
nota: Tutti gli ulteriori passaggi vengono eseguiti in condizioni sterili.
- Metti un colino nella piastra di Petri per lavare il PCLS. Rimuovere completamente il terreno di coltura con una pipetta sierologica da 10 mL attraverso il filtro cellulare e aggiungere 25 mL di terreno fresco preriscaldato a 37 °C. Ripetere questo passaggio 3 - 4 volte ogni 30 minuti.
nota: Il filtro cellulare impedisce che le fette vengano aspirate nella pipetta, per evitare danni alle fette.
- Trasferire con cura le fette di polmone in una piastra di coltura a 24 pozzetti con un minimo di 500 μL di terreno di coltura per due fette per pozzetto. Esporre il tessuto polmonare a sostanze (vedere i passaggi 3.1 - 3.4), ad es. per 24 ore a 37 °C, 5% CO2.
nota: Per il trasferimento, utilizzare preferibilmente un anello di inoculazione e lasciare che le fette galleggino sul passante per evitare danni ai tessuti. Non è necessaria un'ulteriore separazione delle fette, poiché solo una carenza di terreno fresco sufficiente indurrà la morte cellulare nelle fette di tessuto. Le fette possono sovrapporsi o toccarsi nel pozzetto: questo non ha alcuna influenza sulla vitalità del tessuto.
- Mettere tutto il materiale umano residuo in un pallone di plastica con un fissativo (ad es. formaldeide tamponata al 10%) per almeno 24 ore e bruciarlo durante il processo di smaltimento.
cautela: La formaldeide è tossica, eseguire questo passaggio sotto una cappa.
2. Preparazione di soluzioni per sostanze
NOTA: Prepara soluzioni e controlli funzionanti immediatamente prima dell'uso.
ATTENZIONE: Maneggiare le sostanze secondo le istruzioni di sicurezza o, se sconosciute, come potenzialmente dannose e seguire le precauzioni di sicurezza di routine.
- Sciogliere le sostanze idrosolubili direttamente nel terreno di coltura. Per le sostanze chimiche insolubili o scarsamente solubili, sciogliere prima la sostanza nei solventi appropriati a seconda della solubilità della sostanza. Le sostanze con solubilità in acqua limitata (<0,1 mg/mL) possono essere disciolte, ad esempio, in dimetilsolfossido (DMSO) o etanolo. Le concentrazioni di solventi non tossici devono essere determinate preventivamente mediante titolazione. Assicurarsi che le sostanze non precipitino fuori dalla soluzione quando diluite nel mezzo.
NOTA: vengono preparate le soluzioni di esacloroplatinato di ammonio (HClPt) e sodio laureth solfato (SLS).
- Preparare le soluzioni madre della sostanza a 100 volte la concentrazione massima desiderata nel terreno di coltura o nel solvente. Pesare 12,5 mg di HClPt e 34,4 mg di SLS e preparare le soluzioni madre sciogliendo le sostanze chimiche in 1 mL di terreno di coltura.
nota: Per queste sostanze chimiche non è necessario alcun solvente.
- Preparare una diluizione finale di 1:100 in un mezzo preriscaldato. Nel caso di un uso precedente del solvente, questo approccio si traduce nella stessa concentrazione finale di solvente per tutte le concentrazioni di sostanze.
- Utilizzare la concentrazione finale del solvente (ad es. 1% come descritto al punto 3.3) per il trattamento di riferimento del PCLS. Non è stato richiesto alcun controllo del solvente per le sostanze chimiche menzionate nella sezione dei risultati.
3. Riferimenti positivi e negativi per i saggi di citotossicità
- Per tutti i test di vitalità, preparare i seguenti controlli positivi e negativi:
- Controllo tissutale: incubare PCLS in un terreno di coltura solo come riferimento per PCLS non trattati per 24 ore in condizioni di coltura cellulare (37 °C, 5% CO2, 100% di umidità).
- Controllo del veicolo (se necessario): incubare PCLS con la concentrazione finale di solvente come riferimento per PCLS trattati solo con mezzo disperdente (vedere punto 3.4) per 24 ore in condizioni di coltura cellulare (37 °C, 5% CO2, 100% di umidità).
- Controllo positivo: incubare PCLS con detergente all'1% in soluzione tampone per 1 ora a 4 °C.
nota: Se la PCLS diventa incolore, il tessuto è morto. La L-lattato deidrogenasi totale (LDH) è determinata nel surnatante, con un assorbimento di circa 1,9 - 2,3. Il tessuto viene utilizzato per il test WST-1, con un assorbimento di circa 0.
4. Misurazione della citotossicità indotta chimicamente nel PCLS umano mediante saggio del sale di tetrazolio solubile in acqua (WST-1).
NOTA: Il test WST-1 viene eseguito in una piastra a 24 pozzetti con due PCL per pozzetto. Preferibilmente, utilizzare duplicati per ogni parametro e raggruppare i risultati di questi duplicati dopo la misurazione.
- Preparare la soluzione di lavoro diluendo il reagente WST-1 nel terreno immediatamente prima di iniziare. La quantità richiesta di soluzione di lavoro è di 250 μL/pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Pertanto, mescolare 25 μl del reagente con 225 μl del terreno di coltura per un pozzetto.
- Dopo l'incubazione del PCLS dal passaggio 1.16, scartare o utilizzare il surnatante per le misurazioni delle citochine o altri test come il test LDH. Il tessuto rimanente viene utilizzato per la fase successiva.
- Pipettare 250 μl della concentrazione di lavoro del reagente WST-1 per pozzetto e incubare la piastra a 37 °C e 5% di CO2 per 1 ora. Assicurarsi che i PCLS siano completamente coperti dal reagente WST-1 durante l'incubazione.
- Posizionare la piastra su un agitatore orbitale (200 giri/min) e agitare accuratamente per 30 s per garantire una miscelazione accurata del reagente WST-1. Prelevare una nuova piastra a fondo piatto da 96 pozzetti e pipettare 100 μl in duplicati dal surnatante di ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti.
- Misurare l'assorbimento di ciascun pozzetto a 450 nm (riferimento: 630 nm) utilizzando un lettore di micropiastre. Sottrarre l'assorbimento a 630 nm da 450 nm. nota: Dati affidabili per la valutazione della citotossicità possono essere ottenuti solo da tessuti vitali. Pertanto, questi criteri di accettazione pubblicati dovrebbero essere soddisfatti in ogni esperimento. Se questi criteri non sono soddisfatti, l'esperimento deve essere ripetuto.
- L'assorbimento del controllo del mezzo non trattato deve essere superiore a 0,6, altrimenti l'esperimento deve essere ripetuto. Se i dati soddisfano questo requisito, impostare il valore di assorbimento del controllo tissutale al 100% e calcolare la riduzione WST-1 dei campioni trattati in relazione al controllo tissutale.
