Un test basato sulla fluorescenza che utilizza linfociti ingegnerizzati per lo screening di composti immunomodulatori

Abstract

Fonte: Fouda, A., et al., Un test dei linfociti basato sulla fluorescenza adatto per lo screening ad alto rendimento di piccole molecole. J. Vis. Exp., (2017).

Questo video dimostra lo screening di composti immunomodulatori tramite test basati sulla fluorescenza. I linfociti T transgenici derivati da topi con cassette di espressione proteica fluorescente verde sono trattati con questi composti. I segnali GFP potenziati e ridotti consentono l'identificazione degli effetti stimolatori e inibitori dei composti, rispettivamente.

Protocol

1. Preparazione del terreno splenocitico e del tampone per citometria a flusso

1. Eseguire tutti i passaggi sotto una cappa biologica pulita con etanolo al 70%.
2. Rimuovere 70 mL di terreno preriscaldato del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 1x (disponibile in commercio e fornito in flaconi sterili filtrati da 500 ml di volume) e metterli in una provetta sterile. Il supporto rimosso verrà utilizzato più avanti nel protocollo.
3. Integrare i restanti 430 ml di RPMI 1640 1x con 50 ml di siero fetale bovino inattivato (FBS), 5 ml di penicillina/streptomicina, 5 ml di acido N-2-idrossietilpiperazina-N-2-etano solfonico (H....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Topi Nur77GFP	Il laboratorio Jackson	Ceppo di topo n. 016617	Una colonia interna è stata stabilita presso la nostra struttura per animali
Piastre di coltura 96 pozzetti-U, sterili	VWR Internazionale	Codice 10062-902	Attivazione delle cellule T utilizzando le perline magnetiche
Filtro cellulare da 70μm, sterile	Corning Inc.	Codice 352350	Generazione di sospensione cellulare di splenociti
5 ml di tubi in polistirene a fondo tondo, sterili	Corning Inc.	352058	Generazione di sospensione cellulare di splenociti
Provette da 50 ml in polipropilene a fondo conico, sterili	VWR Internazionale	Codice 89039-656	Generazione di sospensione cellulare di splenociti
Siringa da 10 ml senza ago, sterile	Becton, Dickinson e compagnia	305482	Per schiacciare la milza
Piatto per coltura cellulare da 5 ml, sterile	Greiner Bio-One	627 160	Per schiacciare la milza
Penicillina- Streptomicina (10.000 U/mL)	WISENT Inc.	450-200-EL	Componente del mezzo splenocitario
RPMI 1600 con bicarbonato di sodio e L-glutammina	WISENT Inc.	350-002-CL	Componente del mezzo splenocitario
Aminoacidi non essenziali MEM	WISENT Inc.	321-010-EL	Componente del mezzo splenocitario
HEPES acido libero 1 M	WISENT Inc.	330-050-EL	Componente del mezzo splenocitario
Soluzione di piruvato di sodio (100mM)	WISENT Inc.	600-110-EL	Componente del mezzo splenocitario
Siero fetale bovino (FBS)	WISENT Inc.	Codice 080-910	Componente del terreno splenocitario e tampone per citometria a flusso
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	WISENT Inc.	311-010-CL	Componente del tampone per citometria a flusso
2-Mercaptoetanolo (55mM)	Thermo Fisher Scientifico	Codice: 21985-023	Componente del mezzo splenocitario
Kit di isolamento delle cellule T	Tecnologie delle cellule staminali	Anno 19851	Per isolare le cellule T
Perle superparamagnetiche T-Activator CD3/CD28 per topi	Thermo Fisher Scientifico	Codice 11452D	Per attivare le cellule T
Magnete di isolamento cellulare	Tecnologie delle cellule staminali	18000	Per isolare le cellule T e rimuovere le microsfere magnetiche
IL-7 murina ricombinante	Peprotech	217-17	Per supportare la sopravvivenza delle cellule T durante l'attivazione
Anticorpo CD3 anti-topo	BD Pharmingen	561799	Per colorare le cellule T per la citometria a flusso
Biomed FXp	PerkinElmer Inc.	Codice: A31842	Per risospendere le cellule dopo 24 ore di incubazione
Sistema di screening ad alto contenuto Opera Phenix	PerkinElmer Inc.	HH14000000	Per analizzare il segnale GFP/Hoechst