Un test basato sulla fluorescenza che utilizza linfociti ingegnerizzati per lo screening di composti immunomodulatori

Abstract

Fonte: Fouda, A., et al., Un test dei linfociti basato sulla fluorescenza adatto per lo screening ad alto rendimento di piccole molecole. J. Vis. Exp., (2017).

Questo video dimostra lo screening di composti immunomodulatori tramite test basati sulla fluorescenza. I linfociti T transgenici derivati da topi con cassette di espressione proteica fluorescente verde sono trattati con questi composti. I segnali GFP potenziati e ridotti consentono l'identificazione degli effetti stimolatori e inibitori dei composti, rispettivamente.

Protocol

1. Preparazione del terreno splenocitico e del tampone per citometria a flusso

1. Eseguire tutti i passaggi sotto una cappa biologica pulita con etanolo al 70%.
2. Rimuovere 70 mL di terreno preriscaldato del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 1x (disponibile in commercio e fornito in flaconi sterili filtrati da 500 ml di volume) e metterli in una provetta sterile. Il supporto rimosso verrà utilizzato più avanti nel protocollo.
3. Integrare i restanti 430 ml di RPMI 1640 1x con 50 ml di siero fetale bovino inattivato (FBS), 5 ml di penicillina/streptomicina, 5 ml di acido N-2-idrossietilpiperazina-N-2-etano solfonico (HEPES), 5 ml di aminoacidi non essenziali, 5 ml di piruvato di sodio e 0,05 ml di 2-mercaptoetanolo filtrato (1M).
   nota: Preriscaldare il terreno splenocitario utilizzando un bagno d'acqua impostato a 37 ºC per evitare shock termici nelle cellule. Questo è importante per evitare l'induzione dell'apoptosi cellulare.
4. Per preparare il tampone per citometria a flusso, aggiungere 2 ml di FBS a 98 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e conservare in frigorifero fino all'uso (preferibilmente entro tre giorni).

2. Generazione di sospensione di cellule splenocitarie da milza di topo^GFP Nur77

1. Isolare asetticamente la milza da una femmina di topo Nur77^GFP di 6-8 settimane.
   1. Per raggiungere questo obiettivo, lavorare sotto una cappa sterile. Immergere la pelliccia di topo sacrificata, le forbici e le pinze in etanolo al 70%.
   2. Appoggia il topo sul lato destro e taglia la pelle e i muscoli nel quadrante addominale in alto a sinistra. Ispezionare l'area dell'incisione per individuare visibilmente la milza, quindi ritagliarla. Mantenere la milza in mezzo splenocitario sul ghiaccio fino al momento di eseguire il passaggio successivo.
2. Trasferire la milza o le milze in una capsula di Petri per colture cellulari di 10^cm2 contenente 5 ml di terreno splenocitario preriscaldato.
3. Schiacciare la milza usando uno stantuffo a siringa sterile fino a quando la soluzione non è torbida. Alla fine della procedura dovrebbe rimanere una matrice di collagene della milza.
4. Dopo un'estesa frantumazione in terreno di splenocito, raccogliere la sospensione cellulare e farla passare attraverso un filtro cellulare da 70 μm posizionato su una provetta da 50 ml per filtrare eventuali detriti o coaguli.
5. Centrifugare a 500 x g per 5 min. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 2-3 mL di tampone per lisi dei globuli rossi prodotto internamente o in commercio. Dopo il pipettaggio (2-3 volte), lasciare riposare la sospensione per 20-30 s.
6. Aggiungere 5 mL di PBS o un tampone adatto a scelta, quindi centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 500 x g.
7. Rimuovere il surnatante (dovrebbe essere di colore rosso in quanto contiene globuli rossi lisati) e risospendere il pellet cellulare in 2 ml di terreno splenocitario.
8. Utilizzando un emocitometro, contare il numero di cellule colorate con blu di tripano per distinguere tra cellule vive e morte (necrotiche).

3. Isolamento delle cellule T dalla sospensione delle cellule splenocitarie

1. Centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 500 x g. Risospendere le cellule in terreno RPMI privo di siero (50 ml dal passaggio 1.3) per ottenere una concentrazione cellulare di 10 x 10⁶ cellule/mL.
2. Trasferire le cellule in una provetta di polistirene da 5 ml e mettere da parte un'aliquota di 100 μl di splenociti per la valutazione/il confronto della purezza al termine della fase di purificazione.
3. Aggiungere siero di ratto normale alla sospensione cellulare a 50 μL/mL seguito da un cocktail di anticorpi per l'isolamento delle cellule T (50 μL/mL).
4. Mescolare la sospensione cellulare e lasciarla riposare per 10 minuti. Questo passaggio consente al cocktail di anticorpi di legare tutte le cellule indesiderate.
5. Aggiungere le sfere rapide di streptavidina (biglie magnetiche) per 2,5 minuti, quindi portare il volume a 2,5 ml utilizzando il terreno privo di siero.
6. Posizionare la provetta in un magnete di isolamento cellulare per 3 minuti.
7. Trasferisci la sospensione delle cellule T in un nuovo tubo di polistirene tenendo premuto il magnete e versando la soluzione in una sola mossa.
   nota: La sospensione isolata contiene le cellule T purificate. Tutte le cellule indesiderate sono tenute sul lato del tubo legato alle perle magnetiche di streptavidina.
8. Contare le cellule T isolate utilizzando il blu di tripano e un emocitometro.
   nota: In questa fase, la purezza delle cellule T isolate può essere verificata (opzionale) analizzando la percentuale di eventi CD3⁺ prima e dopo l'isolamento delle cellule T mediante citometria a flusso.
   1. In breve, centrifugare 1 ml di sospensione di cellule splenocitarie a 500 x g. Scartare il surnatante e sospendere le cellule in un tampone per citometria a flusso a una concentrazione di 1 x 10⁶ cellule/mL.
   2. Aggiungere anticorpi CD3 anti-topo marcati con fluorescenza a una concentrazione di 1:100. Incubare a 4 °C per 30 min. Lavare una volta, centrifugare e risospendere in tampone per citometria a flusso (400 μl) per l'analisi mediante citometria a flusso.

4. Attivazione delle cellule T e induzione dell'espressione della proteina fluorescente verde (GFP)

1. Seminare le cellule T, in sospensione, in una piastra a 96 pozzetti a fondo tondo a una concentrazione di 2,5 x 10⁵ cellule/pozzetto.
2. Aggiungere interleuchina (IL)-7 ricombinante a 2 ng/mL e biglie magnetiche CD3/CD28 (25 μL/10⁶ cellule). Conservare una parte delle cellule T non trattata con perline che fungano da controllo negativo per misurazioni successive che rappresentano cellule T non attivate.
3. Dodici ore dopo, prelevare le cellule T dalla piastra a 96 pozzetti pipettando delicatamente la sospensione cellulare in ciascun pozzetto su e giù per rompere eventuali complessi/aggregati di perline. Raccogliere la sospensione da tutti i pozzetti in una provetta di polistirene da 5 mL.
4. Posizionare il tubo contenente la sospensione all'interno dello stesso magnete di isolamento cellulare utilizzato in precedenza per la purificazione delle cellule T e lasciarlo riposare per 5 minuti.
5. Trasferisci la sospensione delle cellule T in un nuovo tubo di polistirene tenendo premuto il magnete e versando la soluzione in una sola mossa.
6. Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 minuti. Risospendere le cellule in terreno di splenociti fresco per ottenere una concentrazione di 2 x 10⁶ cellule/mL.
7. Valutare l'intensità dell'espressione della GFP mediante citometria a flusso (opzionale per il controllo di qualità) da 12 a 24 ore dopo la stimolazione rispetto alle cellule T non attivate. ¹²
   nota: La fluorescenza GFP è intrinseca alle cellule^{T GFP} Nur77 e si manifesta dopo l'attivazione del recettore delle cellule T, TCR.
8. Per la valutazione della vitalità e dell'attivazione (opzionale) mediante microscopia, colorare le cellule attivate con Hoechst 30 minuti prima dell'analisi a una concentrazione di 0,2 μg/ml. Aggiungere un volume adeguato della sospensione cellulare a un vetrino di copertura o a un pozzetto di una piastra a 384 pozzetti a fondo piatto con lato nero ed esaminare al microscopio a fluorescenza per valutare le cellule viventi. Le cellule morte non manterranno la colorazione nucleare.

5. Screening ad alto rendimento (HTS) di piccole molecole

1. Preparare una sospensione cellulare a 2 x 10⁶ cellule/mL di cellule T attivate (biglie magnetiche o anticorpi/CD40L) o gruppi non attivati.
2. Piastra 75.000 cellule/pozzetto in una piastra da 384 pozzetti (volume di 40 μl). Utilizzare una piastra a 384 pozzetti a fondo piatto con lato nero o un vetrino di copertura del microscopio per la valutazione della vitalità e dell'attivazione mediante microscopia a fluorescenza (fase di controllo qualità opzionale prima dell'HTS) utilizzando la colorazione Hoechst (fare riferimento ai passaggi 4.8 per i dettagli).
3. Manualmente o utilizzando un sistema automatizzato, aggiungere i farmaci di scelta (disciolti in 0,5% di dimetilsolfossido, DMSO) a ciascun pozzetto.
4. Aggiungere il veicolo (DMSO) ai pozzetti di controllo positivi (attivati) e negativi (non attivati). Regolare la concentrazione di DMSO a un massimo dello 0,5%.
5. Incubare le piastre per 24 ore (o tempo di incubazione a scelta) a 37 ºC e 5% di anidride carbonica, CO₂.
6. Il giorno dello screening, diluire la soluzione colorante Hoechst 33342 (1:3,333; ad es. aggiungere 10 μl alle cellule nelle piastre a 384 pozzetti per generare un volume totale di 50 μl). Colorare 30 minuti prima dell'analisi GFP aggiungendo la soluzione di Hoechst per ottenere una concentrazione di 0,2 μg/mL.
7. Pipettare delicatamente le cellule verso l'alto e verso il basso per ottenere una distribuzione omogenea in ogni pozzetto.
   nota: Questa fase è importante nel caso di dispensazione dei farmaci (fase 5.3) utilizzando un sistema automatizzato in quanto le cellule tendono ad accumularsi su un lato del pozzetto, opposto alla direzione del flusso.
8. Centrifugare i piatti a 45 x g per 3 minuti a temperatura ambiente.
9. Lasciare riposare i piatti per 15 minuti a temperatura ambiente.
10. Eseguire la lettura delle piastre, utilizzando il sistema di screening confocale automatizzato ad alto contenuto (HCS). Caricare la lastra sulla macchina. Impostare l'obiettivo su un ingrandimento di 40X o superiore. Utilizzare la fotocamera #4 per Hoechst (lampada UV) e la fotocamera #1 per GFP (laser 488). Impostare la macchina per leggere 6-10 campi per pozzetto. Regolare la macchina per eseguire due letture sequenziali per campo a 488 nm (per leggere GFP) e luce UV (per leggere Hoechst). Impostare l'obiettivo su un ingrandimento di 40X o superiore.
    nota: Il sistema è un microscopio computerizzato che non richiede alcuna regolazione. La distanza focale, l'intensità della luce incidente e il tempo di esposizione sono tutti impostati automaticamente dalla macchina.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Topi Nur77GFP	Il laboratorio Jackson	Ceppo di topo n. 016617	Una colonia interna è stata stabilita presso la nostra struttura per animali
Piastre di coltura 96 pozzetti-U, sterili	VWR Internazionale	Codice 10062-902	Attivazione delle cellule T utilizzando le perline magnetiche
Filtro cellulare da 70μm, sterile	Corning Inc.	Codice 352350	Generazione di sospensione cellulare di splenociti
5 ml di tubi in polistirene a fondo tondo, sterili	Corning Inc.	352058	Generazione di sospensione cellulare di splenociti
Provette da 50 ml in polipropilene a fondo conico, sterili	VWR Internazionale	Codice 89039-656	Generazione di sospensione cellulare di splenociti
Siringa da 10 ml senza ago, sterile	Becton, Dickinson e compagnia	305482	Per schiacciare la milza
Piatto per coltura cellulare da 5 ml, sterile	Greiner Bio-One	627 160	Per schiacciare la milza
Penicillina- Streptomicina (10.000 U/mL)	WISENT Inc.	450-200-EL	Componente del mezzo splenocitario
RPMI 1600 con bicarbonato di sodio e L-glutammina	WISENT Inc.	350-002-CL	Componente del mezzo splenocitario
Aminoacidi non essenziali MEM	WISENT Inc.	321-010-EL	Componente del mezzo splenocitario
HEPES acido libero 1 M	WISENT Inc.	330-050-EL	Componente del mezzo splenocitario
Soluzione di piruvato di sodio (100mM)	WISENT Inc.	600-110-EL	Componente del mezzo splenocitario
Siero fetale bovino (FBS)	WISENT Inc.	Codice 080-910	Componente del terreno splenocitario e tampone per citometria a flusso
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	WISENT Inc.	311-010-CL	Componente del tampone per citometria a flusso
2-Mercaptoetanolo (55mM)	Thermo Fisher Scientifico	Codice: 21985-023	Componente del mezzo splenocitario
Kit di isolamento delle cellule T	Tecnologie delle cellule staminali	Anno 19851	Per isolare le cellule T
Perle superparamagnetiche T-Activator CD3/CD28 per topi	Thermo Fisher Scientifico	Codice 11452D	Per attivare le cellule T
Magnete di isolamento cellulare	Tecnologie delle cellule staminali	18000	Per isolare le cellule T e rimuovere le microsfere magnetiche
IL-7 murina ricombinante	Peprotech	217-17	Per supportare la sopravvivenza delle cellule T durante l'attivazione
Anticorpo CD3 anti-topo	BD Pharmingen	561799	Per colorare le cellule T per la citometria a flusso
Biomed FXp	PerkinElmer Inc.	Codice: A31842	Per risospendere le cellule dopo 24 ore di incubazione
Sistema di screening ad alto contenuto Opera Phenix	PerkinElmer Inc.	HH14000000	Per analizzare il segnale GFP/Hoechst