1. Preparazione del terreno splenocitico e del tampone per citometria a flusso
- Eseguire tutti i passaggi sotto una cappa biologica pulita con etanolo al 70%.
- Rimuovere 70 mL di terreno preriscaldato del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 1x (disponibile in commercio e fornito in flaconi sterili filtrati da 500 ml di volume) e metterli in una provetta sterile. Il supporto rimosso verrà utilizzato più avanti nel protocollo.
- Integrare i restanti 430 ml di RPMI 1640 1x con 50 ml di siero fetale bovino inattivato (FBS), 5 ml di penicillina/streptomicina, 5 ml di acido N-2-idrossietilpiperazina-N-2-etano solfonico (HEPES), 5 ml di aminoacidi non essenziali, 5 ml di piruvato di sodio e 0,05 ml di 2-mercaptoetanolo filtrato (1M).
nota: Preriscaldare il terreno splenocitario utilizzando un bagno d'acqua impostato a 37 ºC per evitare shock termici nelle cellule. Questo è importante per evitare l'induzione dell'apoptosi cellulare.
- Per preparare il tampone per citometria a flusso, aggiungere 2 ml di FBS a 98 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e conservare in frigorifero fino all'uso (preferibilmente entro tre giorni).
2. Generazione di sospensione di cellule splenocitarie da milza di topoGFP Nur77
- Isolare asetticamente la milza da una femmina di topo Nur77GFP di 6-8 settimane.
- Per raggiungere questo obiettivo, lavorare sotto una cappa sterile. Immergere la pelliccia di topo sacrificata, le forbici e le pinze in etanolo al 70%.
- Appoggia il topo sul lato destro e taglia la pelle e i muscoli nel quadrante addominale in alto a sinistra. Ispezionare l'area dell'incisione per individuare visibilmente la milza, quindi ritagliarla. Mantenere la milza in mezzo splenocitario sul ghiaccio fino al momento di eseguire il passaggio successivo.
- Trasferire la milza o le milze in una capsula di Petri per colture cellulari di 10cm2 contenente 5 ml di terreno splenocitario preriscaldato.
- Schiacciare la milza usando uno stantuffo a siringa sterile fino a quando la soluzione non è torbida. Alla fine della procedura dovrebbe rimanere una matrice di collagene della milza.
- Dopo un'estesa frantumazione in terreno di splenocito, raccogliere la sospensione cellulare e farla passare attraverso un filtro cellulare da 70 μm posizionato su una provetta da 50 ml per filtrare eventuali detriti o coaguli.
- Centrifugare a 500 x g per 5 min. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 2-3 mL di tampone per lisi dei globuli rossi prodotto internamente o in commercio. Dopo il pipettaggio (2-3 volte), lasciare riposare la sospensione per 20-30 s.
- Aggiungere 5 mL di PBS o un tampone adatto a scelta, quindi centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 500 x g.
- Rimuovere il surnatante (dovrebbe essere di colore rosso in quanto contiene globuli rossi lisati) e risospendere il pellet cellulare in 2 ml di terreno splenocitario.
- Utilizzando un emocitometro, contare il numero di cellule colorate con blu di tripano per distinguere tra cellule vive e morte (necrotiche).
3. Isolamento delle cellule T dalla sospensione delle cellule splenocitarie
- Centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 500 x g. Risospendere le cellule in terreno RPMI privo di siero (50 ml dal passaggio 1.3) per ottenere una concentrazione cellulare di 10 x 106 cellule/mL.
- Trasferire le cellule in una provetta di polistirene da 5 ml e mettere da parte un'aliquota di 100 μl di splenociti per la valutazione/il confronto della purezza al termine della fase di purificazione.
- Aggiungere siero di ratto normale alla sospensione cellulare a 50 μL/mL seguito da un cocktail di anticorpi per l'isolamento delle cellule T (50 μL/mL).
- Mescolare la sospensione cellulare e lasciarla riposare per 10 minuti. Questo passaggio consente al cocktail di anticorpi di legare tutte le cellule indesiderate.
- Aggiungere le sfere rapide di streptavidina (biglie magnetiche) per 2,5 minuti, quindi portare il volume a 2,5 ml utilizzando il terreno privo di siero.
- Posizionare la provetta in un magnete di isolamento cellulare per 3 minuti.
- Trasferisci la sospensione delle cellule T in un nuovo tubo di polistirene tenendo premuto il magnete e versando la soluzione in una sola mossa.
nota: La sospensione isolata contiene le cellule T purificate. Tutte le cellule indesiderate sono tenute sul lato del tubo legato alle perle magnetiche di streptavidina.
- Contare le cellule T isolate utilizzando il blu di tripano e un emocitometro.
nota: In questa fase, la purezza delle cellule T isolate può essere verificata (opzionale) analizzando la percentuale di eventi CD3+ prima e dopo l'isolamento delle cellule T mediante citometria a flusso.
- In breve, centrifugare 1 ml di sospensione di cellule splenocitarie a 500 x g. Scartare il surnatante e sospendere le cellule in un tampone per citometria a flusso a una concentrazione di 1 x 106 cellule/mL.
- Aggiungere anticorpi CD3 anti-topo marcati con fluorescenza a una concentrazione di 1:100. Incubare a 4 °C per 30 min. Lavare una volta, centrifugare e risospendere in tampone per citometria a flusso (400 μl) per l'analisi mediante citometria a flusso.
4. Attivazione delle cellule T e induzione dell'espressione della proteina fluorescente verde (GFP)
- Seminare le cellule T, in sospensione, in una piastra a 96 pozzetti a fondo tondo a una concentrazione di 2,5 x 105 cellule/pozzetto.
- Aggiungere interleuchina (IL)-7 ricombinante a 2 ng/mL e biglie magnetiche CD3/CD28 (25 μL/106 cellule). Conservare una parte delle cellule T non trattata con perline che fungano da controllo negativo per misurazioni successive che rappresentano cellule T non attivate.
- Dodici ore dopo, prelevare le cellule T dalla piastra a 96 pozzetti pipettando delicatamente la sospensione cellulare in ciascun pozzetto su e giù per rompere eventuali complessi/aggregati di perline. Raccogliere la sospensione da tutti i pozzetti in una provetta di polistirene da 5 mL.
- Posizionare il tubo contenente la sospensione all'interno dello stesso magnete di isolamento cellulare utilizzato in precedenza per la purificazione delle cellule T e lasciarlo riposare per 5 minuti.
- Trasferisci la sospensione delle cellule T in un nuovo tubo di polistirene tenendo premuto il magnete e versando la soluzione in una sola mossa.
- Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 minuti. Risospendere le cellule in terreno di splenociti fresco per ottenere una concentrazione di 2 x 106 cellule/mL.
- Valutare l'intensità dell'espressione della GFP mediante citometria a flusso (opzionale per il controllo di qualità) da 12 a 24 ore dopo la stimolazione rispetto alle cellule T non attivate. 12
nota: La fluorescenza GFP è intrinseca alle celluleT GFP Nur77 e si manifesta dopo l'attivazione del recettore delle cellule T, TCR.
- Per la valutazione della vitalità e dell'attivazione (opzionale) mediante microscopia, colorare le cellule attivate con Hoechst 30 minuti prima dell'analisi a una concentrazione di 0,2 μg/ml. Aggiungere un volume adeguato della sospensione cellulare a un vetrino di copertura o a un pozzetto di una piastra a 384 pozzetti a fondo piatto con lato nero ed esaminare al microscopio a fluorescenza per valutare le cellule viventi. Le cellule morte non manterranno la colorazione nucleare.
5. Screening ad alto rendimento (HTS) di piccole molecole
- Preparare una sospensione cellulare a 2 x 106 cellule/mL di cellule T attivate (biglie magnetiche o anticorpi/CD40L) o gruppi non attivati.
- Piastra 75.000 cellule/pozzetto in una piastra da 384 pozzetti (volume di 40 μl). Utilizzare una piastra a 384 pozzetti a fondo piatto con lato nero o un vetrino di copertura del microscopio per la valutazione della vitalità e dell'attivazione mediante microscopia a fluorescenza (fase di controllo qualità opzionale prima dell'HTS) utilizzando la colorazione Hoechst (fare riferimento ai passaggi 4.8 per i dettagli).
- Manualmente o utilizzando un sistema automatizzato, aggiungere i farmaci di scelta (disciolti in 0,5% di dimetilsolfossido, DMSO) a ciascun pozzetto.
- Aggiungere il veicolo (DMSO) ai pozzetti di controllo positivi (attivati) e negativi (non attivati). Regolare la concentrazione di DMSO a un massimo dello 0,5%.
- Incubare le piastre per 24 ore (o tempo di incubazione a scelta) a 37 ºC e 5% di anidride carbonica, CO2.
- Il giorno dello screening, diluire la soluzione colorante Hoechst 33342 (1:3,333; ad es. aggiungere 10 μl alle cellule nelle piastre a 384 pozzetti per generare un volume totale di 50 μl). Colorare 30 minuti prima dell'analisi GFP aggiungendo la soluzione di Hoechst per ottenere una concentrazione di 0,2 μg/mL.
- Pipettare delicatamente le cellule verso l'alto e verso il basso per ottenere una distribuzione omogenea in ogni pozzetto.
nota: Questa fase è importante nel caso di dispensazione dei farmaci (fase 5.3) utilizzando un sistema automatizzato in quanto le cellule tendono ad accumularsi su un lato del pozzetto, opposto alla direzione del flusso.
- Centrifugare i piatti a 45 x g per 3 minuti a temperatura ambiente.
- Lasciare riposare i piatti per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Eseguire la lettura delle piastre, utilizzando il sistema di screening confocale automatizzato ad alto contenuto (HCS). Caricare la lastra sulla macchina. Impostare l'obiettivo su un ingrandimento di 40X o superiore. Utilizzare la fotocamera #4 per Hoechst (lampada UV) e la fotocamera #1 per GFP (laser 488). Impostare la macchina per leggere 6-10 campi per pozzetto. Regolare la macchina per eseguire due letture sequenziali per campo a 488 nm (per leggere GFP) e luce UV (per leggere Hoechst). Impostare l'obiettivo su un ingrandimento di 40X o superiore.
nota: Il sistema è un microscopio computerizzato che non richiede alcuna regolazione. La distanza focale, l'intensità della luce incidente e il tempo di esposizione sono tutti impostati automaticamente dalla macchina.
