$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.
1. Configurazione dello strumento
NOTA: L'imaging delle celle levitanti richiede che due magneti al neodimio di terre rare magnetizzati sull'asse z siano posizionati con lo stesso polo uno di fronte all'altro per generare un campo magnetico. La distanza tra i magneti può essere personalizzata a seconda dell'intensità del campo magnetico e della densità dei bersagli. In questo caso i magneti sono separati da uno spazio di 1 mm sufficiente per l'inserimento di un tubo capillare in vetro quadrato 1x1 mm lungo 50 mm. Il dispositivo è stato stampato in 3D utilizzando un progetto AutoCAD, disponibile su richiesta.
- Appoggiare il microscopio su un lato, perfettamente orizzontale.
nota: Un microscopio posizionato in una posizione verticale standard non è direttamente adatto per l'imaging di oggetti in levitazione a causa delle posizioni dei magneti rispetto al condensatore e all'obiettivo. Questa limitazione può essere aggirata posizionando il microscopio su un lato, perfettamente orizzontale, consentendo al condensatore di focalizzare la luce nel capillare e alla lente dell'obiettivo di visualizzare la cellula che levita tra i magneti, mantenendo i requisiti di illuminazione Köhler.
- Sostenere e livellare il supporto su un tavolo breadboard utilizzando 2 o 3 martinetti da laboratorio.
- Per limitare le vibrazioni, sostenere il tavolo breadboard con piedini di smorzamento in gomma.
- Rimuovere lo stadio e sostituirlo con un jack da laboratorio compatto per regolare l'altezza del dispositivo di levitazione (asse y) e due stadi di traslazione ad asse singolo, uno per la regolazione della messa a fuoco (asse z) e il secondo per la scansione del tubo capillare.
- Collegare il dispositivo di levitazione magnetica alla presa da laboratorio utilizzando due perni ottici della mini-serie.
2. Legame di anticorpi a microparticelle/microparticelle di carbossi (Modificato da un protocollo di PolyAn)
NOTA: Solo le perle a bassa densità (1,05 g/mL) devono essere rivestite per il rilevamento di Rhesus, Rh(+), ma sia le perle ad alta che quelle a bassa densità sono rivestite per il rilevamento di vescicole extracellulari.
- Prelevare 1 mg equivalente di sospensione di perle e aggiungerlo a 0,5 mL di tampone di attivazione (50 mM di acido 2-(N-morfolino)etansolfonico, MES (MW195,2, 9,72 mg in 1 mL)) pH 5,0 e 0,001% di polisorbato-20).
- Aggiungere 12 μL di 1,5 M 1-etil-3-(3-dimetilamminopropil)carbodiimmide cloridrato (EDC) appena fatto (MW 191,7, 0,28755 g in 1 mL) e 12 μL di 0,3 M Sulfo-N-Idrossisuccinimide (NHS) (MW 217,14, 0,0651 g in 1 mL) in acqua ghiacciata.
- Posizionare i tubi su un agitatore orbitale e agitare energicamente per 1 ora a temperatura ambiente per attivare i gruppi carbossilici sulle perline.
- Interrompere l'attivazione dopo 1 ora aggiungendo 0,5 mL di tampone di accoppiamento (10x soluzione salina tamponata con fosfato, PBS o 0,1 M fosfato pH 7-9).
- Pellettare le perle centrifugando a 20.000 x g per 10 minuti oppure, se le perle non possono essere pellettate, utilizzare un filtro per provette da centrifuga da 0,45 μm. Aspirare il surnatante o il flusso.
- Lavare le perle con 1 mL di 10x PBS 3 volte come al punto 2.5.
- Calcolare 25 μg di anticorpi per mg di perle e mescolare l'anticorpo desiderato con le perle attivate fino a una concentrazione finale di anticorpi di 0,7-1,0 mg/mL in 10X PBS.
- Posizionare i tubi su un bilanciere per tubi impostato a bassa velocità. Arrotolare delicatamente i tubi a temperatura ambiente per una notte per l'accoppiamento.
- Ripetere il passaggio 2.5 e lavare le perline due volte con 1 ml di 10x PBS.
- Lavare con 0,5 mL di etanolammina 1 M (98% brodo = 16,2 M) in tampone pH 8,0 con polisorbato-20 allo 0,02% per 1 ora a temperatura ambiente agitando delicatamente.
- Ripetere il passaggio 2.5 e lavare le perle una volta in 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS). Le microsfere possono essere conservate in 200 μL di DPBS a 4 °C fino al momento del bisogno.
nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
3. Raccolta e preparazione del sangue per la rilevazione di Rh(+)
- Utilizzando un pungidito con un clic, pungere il dito di un donatore Rh(+) e raccogliere 10 μL di sangue in 1 mL di DPBS.
- Colorare le cellule Rh+ con una colorazione fluorescente della membrana plasmatica. Facoltativamente, aggiungere 1 μL di colorante fluorescente alla sospensione da 1 mL di cellule Rh+ (diluizione 1:1000).
- Incubare le cellule con il colorante fluorescente a 37 °C per 15 minuti.
- Pellettare le celle centrifugando a 5.600 x g per 15 s e lavare 3 volte utilizzando 1 mL di DPBS. Risospendere in 1 mL di soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) con calcio e magnesio (HBSS++).
- Utilizzando il pungidito con un clic, pungere il dito di un donatore Rh(-) e raccogliere 2 μL di sangue.
nota: Se si preparano più di 2 condizioni, raccogliere una quantità di sangue sufficiente per aggiungere 1 μL di sangue Rh(-) a ciascuna provetta.
- Preparare le provette sperimentali necessarie: solo perline, controllo delle immunoglobuline G (IgG), campione.
- Solo sfere: aggiungere 174 μL di HBSS++, 1 μL di microsfere di controllo IgG, 1 μL di microsfere ad alta densità (1,2 g/mL) e 24 μL di 500 mM Gd3+ (60 mM).
- Controllo IgG: aggiungere 172 μL di HBSS++, 1 μL di microsfere di controllo IgG, 1 μL di microsfere ad alta densità, 1 μL di sangue Rh-, 1 μL di sospensione ematica Rh+ colorata e 24 μL di 500 mM Gd3+.
- La provetta del campione aggiunge 172 μL di HBSS++, 1 μL di perle rivestite anti-RhD, 1 μL di microsfere ad alta densità, 1 μL di sangue Rh-, 1 μL di sospensione ematica Rh(+) colorata e 24 μL di 500 mM Gd3+.
nota: Le perle ad alta densità vengono aggiunte ai campioni Rh come riferimento.
4. Analisi delle cellule sul dispositivo a levitazione magnetica
- Eseguire l'avvio dello strumento secondo le istruzioni del produttore.
- Caricare 50 μl di campione in una provetta capillare fino a riempire la provetta. Sigillare le estremità del tubo capillare con sigillante capillare assicurandosi che non siano presenti bolle d'aria.
- Caricare il tubo capillare nel supporto tra i magneti superiore e inferiore. Regola il tavolino e la messa a fuoco per una visione ottimale.
nota: Le celle/perle possono impiegare da 5 a 20 minuti per raggiungere la loro posizione di equilibrio magnetico in base alla loro densità e alla concentrazione di Gd3+. Maggiore è la concentrazione di Gd3+, minore è il tempo.