Una tecnica in vitro per studiare l'interazione delle cellule T con i doppi strati lipidici planari supportati

Abstract

Fonte: Steblyanko, M., et al. Valutazione dell'interfaccia sinaptica delle cellule T umane primarie dal sangue periferico e dal tessuto linfoide. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video dimostra una tecnica in vitro per studiare la formazione di sinapsi immunitarie tra le cellule T umane primarie e i doppi strati lipidici supportati (SLB). Le proteine della superficie delle cellule T interagiscono con i rispettivi ligandi immobilizzati su SLB per formare una sinapsi immunitaria, seguita dal movimento dei granuli litici verso la sinapsi, che viene visualizzato utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Protocollo

Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

1. Isolamento di cellule T CD4⁺ per un'analisi di immagini

1. Scongelare un'aliquota da 1 mL contenente 10-7 cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) congelate o cellule mononucleate linfonodali (LNMC) da campioni raccolti. In una cappa sterile, aggiungere le cellule scongelate a 9 ml di RPMI integrati con penicillina/streptomicina e glutammina.
   1. Centrifugare le cellule per 10 minuti a 300 x g a 4 °C, aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 5 mL di RPMI integrato contenente il 10% di FBS (terreno completo). Incubare le cellule per una notte in un incubatore di CO₂ a 37 °C.
2. Il giorno successivo, purificare le cellule T CD4⁺ mediante selezione immunomagnetica negativa utilizzando un kit disponibile in commercio secondo le istruzioni del produttore.
3. Per misurare il numero di cellule T CD4⁺ appena purificate, mescolare 5 μl della sospensione cellulare con un volume uguale di una soluzione di blu di tripano. Caricare un emocitometro con una miscela di cellule e tripano blu e contare le cellule vive all'interno delle 5 sezioni dell'emocitometro.
4. Prendere la media del numero di cellule e determinare il numero di cellule nella sospensione cellulare originale: il numero di cellule/1 mL = il conteggio medio x 2 x 10⁴. Se il numero totale di celle isolate è troppo piccolo, utilizzare le celle così come sono senza contarle.
5. Centrifugare le cellule a 300 x g per 10 minuti e risospenderle in un tampone di saggio (20 mM HEPES, pH 7,4, 137 mM NaCl, 2 mM Na₂HPO₄, 5 mM D-glucosio, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂ e 1% albumina sierica umana) a 10⁵ cellule/50 μL o meno e mantenere le cellule a 4 °C (per 1-2 ore) fino al momento di Utilizzare negli esperimenti.
6. Smaltire tutti i rifiuti biologici secondo le linee guida istituzionali pertinenti.
7. Se lo si desidera come popolazione cellulare di controllo, preparare cellule T CD8⁺ attivate da PBMC nel sangue del cordone ombelicale, posizionare 10-7 cellule in 5 mL di terreno completo in un pallone di coltura T25 coperto con una miscela di anticorpi anti-CD3 e anti-CD28 rispettivamente a 10 μg/mL e 1 μg/mL.
8. Il giorno successivo, rimuovere le cellule del sangue del cordone ombelicale attivate dal pallone, lavarle 1 volta con un terreno completo fresco ed espandere le cellule in presenza di IL-2 ricombinante (100 U/mL) per 2 settimane.
9. Purificare le cellule T CD8⁺ del sangue cordonale mediante selezione immunomagnetica negativa utilizzando il kit disponibile in commercio secondo le istruzioni del produttore. Contare le cellule e scambiare il terreno con il tampone del saggio come descritto nei passaggi 1.3-1.6 per le cellule T CD8⁺ LN e PB.

2. Componenti per la preparazione dei doppi strati lipidici planari

1. Preparare 3 tipi di liposomi come descritto altrove: (a) liposomi 0,4 mM DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina), (b) liposomi 0,4 mM DOPC contenenti il 33% mol% DOGS-NTA [1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-ammino-1-carbossipentil)acido iminodiacetico)succinil] (sale di ammonio)) lipidi, (c) liposomi 0,4 mM DOPC contenenti il 4 mol% di Biotinyl-Cap-PE [1,2-dioleoyl-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-(biotina del tappo) (sale sodico)).
2. Preparare una soluzione di caseina al 5% come descritto in precedenza.
   1. Sciogliere 5 g di caseina in polvere in 100 ml di acqua ultrapura e aggiungere 350 μl di idrossido di sodio 10 M. Mescolare il tutto su un normale agitatore magnetico a bassa velocità in base alla scala disponibile, a temperatura ambiente per 2 ore e poi per una notte a 4 °C. Regolare il pH a 7,3 e ultracentrifugare la soluzione per 2 ore a 100.000 x g a 4 °C. Filtrare il surnatante con un filtro sterile da 0,22 μm e conservare la soluzione in aliquote a -80 °C.
      cautela: La soluzione di idrossido di sodio può causare ustioni chimiche e può indurre cecità permanente a contatto con gli occhi. Utilizzare guanti di gomma, indumenti di sicurezza e protezione per gli occhi quando si maneggia questa sostanza chimica o le sue soluzioni.
3. Marcare gli anticorpi anti-CD3 con biotina per produrre molecole di anticorpi mono-biotinilati con un approccio precedentemente descritto.
   1. Preparare una soluzione di Biotina-PEO4-NHS in dimetilsolfossido (DMSO) a 0,1 mg/mL. Aggiungere 3,7 μL della soluzione di Biotina-PEO4-NHS a 1 mg di anticorpo in 0,5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente 100 mM di bicarbonato di sodio.
   2. Incubare la miscela per 2 ore a temperatura ambiente. Preparare una soluzione di Alexa Fluor 488 NHS estere a 10 mg/mL in DMSO. Aggiungere la soluzione di estere Alexa Fluor 488 NHS all'anticorpo marcato da Biotin-PEO4-NHS con un eccesso molare di 10 volte.
   3. Incubare la miscela per 1 ora a temperatura ambiente mescolando lentamente su un normale agitatore magnetico. Separare il colorante non legato utilizzando la cromatografia ad esclusione dimensionale.
   4. Determinare la concentrazione di anticorpi misurando la densità ottica della soluzione di anticorpi a 280 nm (A280). Misurare la densità ottica degli anticorpi marcati a 577 nm (A577).
   5. Determinare il rapporto colorante/anticorpo utilizzando la seguente equazione:
      
      nota: Per ulteriori dettagli, consultare il protocollo del produttore.
4. Esprimere una proteina ricombinante solubile ICAM-1 (Intercellular Adhesion Molecule 1) in un sistema di espressione di Drosophila, come descritto in precedenza.
   1. Clonare, codificando per cDNA, l'ectodominio di ICAM-1 nel vettore di espressione pMT/V5-His di Drosophila con un promotore inducibile di metallotioneina per produrre una proteina ricombinante con aggiunta di un tag His6 all'estremità C-terminale.
   2. Co-trasfettare le cellule S2 con il plasmide ICAM-1 risultante e un vettore di espressione della geneticina (G418). Selezionare i transfettanti stabili utilizzando i terreni di Drosophila di Schneider integrati con il 10% di siero fetale di vitello (FCS) e 0,5 mg/mL di G418 per 3 settimane. Espandere le cellule in terreno di insetto privo di siero e indurre un'espressione proteica con 0,5 mM di CuSO₄ per 3 giorni.
   3. Concentrare il surnatante di coltura 10 volte e dializzare contro PBS tramite un concentratore a flusso tangenziale come descritto in precedenza.
   4. Applicare il surnatante di coltura concentrato su una colonna contenente Sepharose con un anticorpo monoclonale anti-ICAM-1 immobilizzato covalentemente ed eluire l'ICAM-1 legato con un tampone glicina 50 mM, pH 3,0. Neutralizzare immediatamente la proteina ICAM-1 eluita con un tampone Tris 2 M, pH 8,0.
   5. Dializzare il materiale eluito rispetto a PBS, pH 8,0 e aggiungere il materiale dializzato a una colonna contenente agarosio Ni-NTA (acido nichel-nitriloacetico). Eluire ICAM-1 solubile con 200 mM di imidazolo, pH 8,0. Dializzare il materiale eluito con un tampone PBS, pH 8,0.
   6. Etichettare l'ICAM-1 purificato con l'estere Cianina5 N-idrossisuccinimide (Cy5 NHS) secondo le istruzioni del produttore.
      nota: Il miglior rapporto finale-colorante/proteina è 1:1.
5. Produrre frammenti di Fab da un anticorpo anti-CD107a mediante digestione della papaina e purificare i frammenti Fab mediante cromatografia a scambio ionico come descritto in precedenza. Etichettare i frammenti Fab con Alexa Fluor 568 NHS ester secondo le istruzioni del produttore.

3. Formazione di doppi strati lipidici planari supportati da vetro

1. Preparare una soluzione acida di piranha fresca mescolando 140 ml di acido solforico concentrato e 60 ml di perossido di idrogeno al 30%. Lavare i vetrini coprioggetti per i vetrini di flusso immergendoli nella soluzione acida di piranha per 30 minuti. Tenere il vetrino coprioggetti in vetro con una pinza a forbice in polipropilene.
   cautela: La soluzione di piranha è un ossidante estremamente forte. Ricordarsi di indossare sempre occhiali di sicurezza o una visiera integrale insieme a guanti di gomma spessi durante la manipolazione della soluzione. Lavorare solo con la soluzione piranha sotto una cappa aspirante. Evitare di riscaldarlo, trasportarlo o scuoterlo in qualsiasi momento durante l'uso, poiché potrebbe esplodere. Raccogli i rifiuti dei piranha in una bottiglia di vetro con un foro contenente piombo. Contattare il Comitato Istituzionale per la Sicurezza per il corretto utilizzo dei rifiuti.
2. Sciacquare i vetrini coprioggetti lavati 7 volte con acqua ultrapura trasferendoli in sequenza in bicchieri contenenti acqua fresca. Metti da parte i vetrini coprioggetti bagnati per far scivolare via l'acqua rimanente dal vetro pulito, lasciando dietro di sé il vetro asciutto.
   1. In alternativa, utilizzare un puntale per pipetta collegato a una pompa a vuoto per rimuovere con cura le goccioline d'acqua rimanenti dai vetrini.
3. Nella cappa sterile, eseguire diluizioni di vari lipidi per produrre la miscela di liposomi per la realizzazione di doppi strati. Innanzitutto, combinare 37 μL di liposomi DOPC e 3 μL di liposomi Biotinyl-Cap-PE. In secondo luogo, mescolare 14 μL di liposomi DOPC e 15 μL di liposomi DOGS-NTA. In terzo luogo, aggiungere 1 μl della prima miscela a 29 μl della seconda miscela per fabbricare la miscela finale di liposomi.
4. Nella cappa sterile, allestire un'area di lavoro con vetrini coprioggetti asciutti nelle vicinanze. Aliquotare 2 μl della miscela di liposomi finale (vedere il passaggio 3.3) esattamente al centro di un canale di scorrimento autoadesivo. Allineare immediatamente e in modo molto preciso un vetrino coprioggetti pulito e asciutto con il vetrino e abbassare delicatamente il vetrino coprioggetti sul lato adesivo del vetrino.
   1. Se si prepara più di un vetrino, lavorare su un vetrino alla volta poiché la miscela di liposomi evapora rapidamente. Capovolgere il vetrino e utilizzare l'anello esterno di pinze a forbice in polipropilene per applicare una leggera pressione al contatto periferico del vetrino coprioggetti con il vetrino, assicurandosi che il vetrino sia saldamente attaccato al vetrino per evitare perdite.
      nota: Non premere contro i canali del vetrino per evitare di rompere o incrinare il vetrino coprioggetti.
   2. Capovolgere nuovamente la diapositiva e segnare la posizione del doppio strato formato, che sembra una goccia tra il vetrino coprioggetti e il vetrino del canale, disegnando 4 punti con un pennarello indelebile attorno al doppio strato sul lato esterno del carrello del gruppo.
5. Prima della prima iniezione di un liquido nel canale, designare una porta del canale come porta di ingresso e l'altra come porta di uscita e mantenere questa designazione per tutta la durata dell'esperimento.
6. Per evitare la formazione di bolle, inserire l'estremità del puntale della pipetta direttamente nella porta di ingresso del canale. Riempire lentamente i canali del vetrino con 50 μl di tampone di saggio caldo (almeno a temperatura ambiente) (vedere il passaggio 1.5 per la composizione del tampone).
7. Preparare una soluzione di cloruro di nichel (II) 0,5 M. Scongelare un'aliquota di 2 mL di soluzione di caseina a bagnomaria a 37 °C per 30 minuti e completarla con una soluzione di cloruro di nichel alla concentrazione finale di 200 μM.
8. Lavare i doppi strati iniettando prima 100 μl della soluzione di caseina nella porta di ingresso del canale e quindi rimuovendo immediatamente 100 μl dalla porta di uscita sul vetrino mediante pipettaggio. Bloccare i doppi strati con la stessa soluzione iniettando 100 μL di soluzione di caseina nella porta di ingresso di ciascun canale e incubando il vetrino per 45 minuti a temperatura ambiente.
9. Scongelare aliquote di Cy5-ICAM-1-His₆ e proteine della streptavidina. Combinare le proteine nel tampone del saggio alla concentrazione finale di 2 μg/mL ciascuna. Centrifugare la soluzione per 30 minuti a 20.000 x g e 4 °C per rimuovere eventuali aggregati.
10. Rimuovere il resto della soluzione bloccante dalla porta di uscita del canale del vetrino mediante pipettaggio. Iniettare 100 μL della soluzione contenente ICAM-1 e streptavidina nella porta di entrata.
11. Incubare il vetrino per 45 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere l'eccesso di soluzione proteica dalla porta di uscita. Lavare il doppio strato 2 volte iniettando prima 100 μl del tampone del saggio nella porta di ingresso del canale e quindi rimuovendo immediatamente 100 μl dalla porta di uscita.
12. Diluire un anticorpo anti-CD3 marcato con Alexa-Fluor-488 con il tampone del test a una concentrazione finale di 2 μg/mL. Iniettare 100 μl della soluzione anticorpale nella porta di ingresso del vetrino e incubarla per 45 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere l'eccesso di soluzione proteica dalla porta di uscita. Lavare il doppio strato 2 volte con 100 μl di tampone di saggio come al punto 3.11.

4. Imaging dell'interazione delle cellule T con il doppio strato planare

1. Preriscaldare il tavolino e l'obiettivo di un microscopio confocale o a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) fino a quando la temperatura non si equilibra a 37 °C. Posizionare il vetrino con il/i bistrato/i sul tavolino riscaldato. Spostare il tavolino in una posizione appropriata in base ai segni di inchiostro e concentrarsi sul doppio strato utilizzando la fluorescenza delle molecole ICAM-1 marcate con Cy.
   1. Utilizzare un obiettivo 61X per il microscopio confocale o un obiettivo 100X per il microscopio TIRF, con le impostazioni del filtro appropriate.
2. Per l'imaging a rilascio di granuli mediante microscopia TIRF, aggiungere frammenti Fab di anticorpi anti-CD107a marcati con Alexa-Fluor-568 alla sospensione cellulare a una concentrazione finale di 4 μg/mL prima di iniettare le cellule nelle porte di ingresso.
   1. Risospendere le cellule T CD4⁺ preparate isolate da LN PB o sangue del cordone ombelicale e iniettare 50 μl della sospensione cellulare nella porta di ingresso del canale di scorrimento contenente il doppio strato.
3. Scegliere il numero di campi desiderato e registrare le immagini di ciascun campo 1 volta ogni 2 minuti per 30 minuti dopo l'iniezione.
4. Sfrutta il campo luminoso, la luce riflessa e i canali fluorescenti (Alexa 488 e Cy5) del microscopio confocale per acquisire le immagini. Utilizzare la modalità TIRF per la fluorescenza Alexa-Fluor-488 e Alexa-Fluor-568 e il campo largo per la fluorescenza Cy5, nonché l'imaging in campo chiaro, sul microscopio TIRF.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Kit di isolamento delle cellule T CD4, umano	Miltenyl Biotec	Codice 130-096-533
Kit di isolamento delle cellule T CD8, umano	Miltenyl Biotec	130-096-495
DOPC	Avanti Polar Lipids	Codice 850375C
CANI NTA	Avanti Polar Lipids	Codice: 790528C
Biotinyl Cap PE	Avanti Polar Lipids	Codice 870273C
Albumina sierica umana	Octapharma Stati Uniti	NDC 68982-643-01
sticky-Slide VI 0.4	ibidi	Codice 80608
Vetrini coprioggetti per vetrini adesivi	ibidi	Codice 10812
Camera Bioptech FCS2	Bioptech	060319-2-03
anticorpo anti-CD3	Thermo Fisher Scientifico	Codice 16-0037-81	Clone OKT3, le cellule di ibridoma sono disponibili presso ATCC
anticorpo anti-CD28	Genetex	GTX14664	9.3 clonare
caseina	sigma	Visualizzazione del materiale C5890
Biotina-PEO4-NHS	Thermo Fisher Scientifico	Codice 21329
Dmso	sigma	D2650-5
Kit di etichettatura delle proteine Alexa Fluor 488 con colonna per la purificazione delle proteine marcate	Thermo Fisher Scientifico	Codice: A10235
Kit di etichettatura delle proteine Alexa Fluor 568 con colonna per la purificazione delle proteine marcate	Thermo Fisher Scientifico	Codice: A10238
Estere di Amersham Cy5 NHS	GE Scienze della Vita	PA15101
Vettori di espressione di Drosophila pMT/V5-His A, B, C	Thermo Fisher Scientifico	V412020
pcopneo, vettore di espressione di Drosophila G418 per la selezione positiva	ATCC	Codice: 37409
Terreni di Drosophial senza siero Insect-XPRESS	Lonza	12-730Q
Ibridoma YN1/1.7.4	ATCC	CRL1878	L'ibridoma secerne anticorpi contro ICAM-1.
Cianogeno bromuro attivato-Sefarosio 4B	Sigma-Aldrich	Codice: C9142	Utilizzato per la preparazione di Sepharose con anticorpo anti-ICAM legato covelentemente.
Concentratore di flusso tangenziale MasterFlex	Cole-Parmer	77601-60 7592-40	Utilizzato per ICAM-1 contenente la concentrazione di surnatante e la dialisi di ICAM-1 contenente surnatante
Sistemi a flusso tangenziale Centramate Lab	Laboratorio Pall	FS002K10 OS010T12 FS005K10	Utilizzato per ICAM-1 contenente la concentrazione di surnatante e la dialisi di ICAM-1 contenente surnatante
Ni-NTA Agarosio	QIAGEN	Codice: 30210
Tubi per dialisi	Spettri/Por	131384
Papaina dal lattice di papaya	sigma	P3125
anticorpo umano di topo contro CD107a	Bioscienze BD	555798	Clone H4A3
Guanti Ansell Blu Naturale	Fisher Scientifico	Codice 19-014-539
Pinze a forbice in polipropilene Nalgene	Thermo Fisher Scientifico	Codice 6320-0010
Streptavidina	ProZyme	SA10
Microscopio confocale	Nikon		Microscopio invertito Nikon TiE dotato di PFS per il controllo della stabilità dell'immagine a lungo termine, obiettivi a olio 60x, 4 laser con linee di eccitazione a 405, 458, 488, 514, 561 e 640 nm, 2 rivelatori GaAsP e 2 PMT ad alta sensibilità, luce trasmessa DIC, tavolino X,Y,Z programmabile per posizioni multiple e stitching di grandi aree, funzioni time lapse, Camera a temperatura e CO2 controllata Tokai-Hit per l'imaging dal vivo e tavolo di isolamento antivibrante
Microscopio TIRF	Andor		Sistema Andor Revolution XD dotato di illuminatore Nikon TIRF-E, laser con 405, 488, 561 e 640 linee, luce trasmessa DIC, testa a disco rotante Yokogawa CSU-X1 per imaging confocale, obiettivo 100/1.49 NA, fotocamera Andor iXon X3 EM-CCD, riscaldatore dell'obiettivo e uno stadio motorizzato piezoelettrico con Perfect Focus System (PFS)