Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Isolamento di cellule T CD4+ per un'analisi di immagini
- Scongelare un'aliquota da 1 mL contenente 10-7 cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) congelate o cellule mononucleate linfonodali (LNMC) da campioni raccolti. In una cappa sterile, aggiungere le cellule scongelate a 9 ml di RPMI integrati con penicillina/streptomicina e glutammina.
- Centrifugare le cellule per 10 minuti a 300 x g a 4 °C, aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 5 mL di RPMI integrato contenente il 10% di FBS (terreno completo). Incubare le cellule per una notte in un incubatore di CO2 a 37 °C.
- Il giorno successivo, purificare le cellule T CD4+ mediante selezione immunomagnetica negativa utilizzando un kit disponibile in commercio secondo le istruzioni del produttore.
- Per misurare il numero di cellule T CD4+ appena purificate, mescolare 5 μl della sospensione cellulare con un volume uguale di una soluzione di blu di tripano. Caricare un emocitometro con una miscela di cellule e tripano blu e contare le cellule vive all'interno delle 5 sezioni dell'emocitometro.
- Prendere la media del numero di cellule e determinare il numero di cellule nella sospensione cellulare originale: il numero di cellule/1 mL = il conteggio medio x 2 x 104. Se il numero totale di celle isolate è troppo piccolo, utilizzare le celle così come sono senza contarle.
- Centrifugare le cellule a 300 x g per 10 minuti e risospenderle in un tampone di saggio (20 mM HEPES, pH 7,4, 137 mM NaCl, 2 mM Na2HPO4, 5 mM D-glucosio, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2 e 1% albumina sierica umana) a 105 cellule/50 μL o meno e mantenere le cellule a 4 °C (per 1-2 ore) fino al momento di Utilizzare negli esperimenti.
- Smaltire tutti i rifiuti biologici secondo le linee guida istituzionali pertinenti.
- Se lo si desidera come popolazione cellulare di controllo, preparare cellule T CD8+ attivate da PBMC nel sangue del cordone ombelicale, posizionare 10-7 cellule in 5 mL di terreno completo in un pallone di coltura T25 coperto con una miscela di anticorpi anti-CD3 e anti-CD28 rispettivamente a 10 μg/mL e 1 μg/mL.
- Il giorno successivo, rimuovere le cellule del sangue del cordone ombelicale attivate dal pallone, lavarle 1 volta con un terreno completo fresco ed espandere le cellule in presenza di IL-2 ricombinante (100 U/mL) per 2 settimane.
- Purificare le cellule T CD8+ del sangue cordonale mediante selezione immunomagnetica negativa utilizzando il kit disponibile in commercio secondo le istruzioni del produttore. Contare le cellule e scambiare il terreno con il tampone del saggio come descritto nei passaggi 1.3-1.6 per le cellule T CD8+ LN e PB.
2. Componenti per la preparazione dei doppi strati lipidici planari
- Preparare 3 tipi di liposomi come descritto altrove: (a) liposomi 0,4 mM DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina), (b) liposomi 0,4 mM DOPC contenenti il 33% mol% DOGS-NTA [1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-ammino-1-carbossipentil)acido iminodiacetico)succinil] (sale di ammonio)) lipidi, (c) liposomi 0,4 mM DOPC contenenti il 4 mol% di Biotinyl-Cap-PE [1,2-dioleoyl-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-(biotina del tappo) (sale sodico)).
- Preparare una soluzione di caseina al 5% come descritto in precedenza.
- Sciogliere 5 g di caseina in polvere in 100 ml di acqua ultrapura e aggiungere 350 μl di idrossido di sodio 10 M. Mescolare il tutto su un normale agitatore magnetico a bassa velocità in base alla scala disponibile, a temperatura ambiente per 2 ore e poi per una notte a 4 °C. Regolare il pH a 7,3 e ultracentrifugare la soluzione per 2 ore a 100.000 x g a 4 °C. Filtrare il surnatante con un filtro sterile da 0,22 μm e conservare la soluzione in aliquote a -80 °C.
cautela: La soluzione di idrossido di sodio può causare ustioni chimiche e può indurre cecità permanente a contatto con gli occhi. Utilizzare guanti di gomma, indumenti di sicurezza e protezione per gli occhi quando si maneggia questa sostanza chimica o le sue soluzioni.
- Marcare gli anticorpi anti-CD3 con biotina per produrre molecole di anticorpi mono-biotinilati con un approccio precedentemente descritto.
- Preparare una soluzione di Biotina-PEO4-NHS in dimetilsolfossido (DMSO) a 0,1 mg/mL. Aggiungere 3,7 μL della soluzione di Biotina-PEO4-NHS a 1 mg di anticorpo in 0,5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente 100 mM di bicarbonato di sodio.
- Incubare la miscela per 2 ore a temperatura ambiente. Preparare una soluzione di Alexa Fluor 488 NHS estere a 10 mg/mL in DMSO. Aggiungere la soluzione di estere Alexa Fluor 488 NHS all'anticorpo marcato da Biotin-PEO4-NHS con un eccesso molare di 10 volte.
- Incubare la miscela per 1 ora a temperatura ambiente mescolando lentamente su un normale agitatore magnetico. Separare il colorante non legato utilizzando la cromatografia ad esclusione dimensionale.
- Determinare la concentrazione di anticorpi misurando la densità ottica della soluzione di anticorpi a 280 nm (A280). Misurare la densità ottica degli anticorpi marcati a 577 nm (A577).
- Determinare il rapporto colorante/anticorpo utilizzando la seguente equazione:
nota: Per ulteriori dettagli, consultare il protocollo del produttore.
- Esprimere una proteina ricombinante solubile ICAM-1 (Intercellular Adhesion Molecule 1) in un sistema di espressione di Drosophila, come descritto in precedenza.
- Clonare, codificando per cDNA, l'ectodominio di ICAM-1 nel vettore di espressione pMT/V5-His di Drosophila con un promotore inducibile di metallotioneina per produrre una proteina ricombinante con aggiunta di un tag His6 all'estremità C-terminale.
- Co-trasfettare le cellule S2 con il plasmide ICAM-1 risultante e un vettore di espressione della geneticina (G418). Selezionare i transfettanti stabili utilizzando i terreni di Drosophila di Schneider integrati con il 10% di siero fetale di vitello (FCS) e 0,5 mg/mL di G418 per 3 settimane. Espandere le cellule in terreno di insetto privo di siero e indurre un'espressione proteica con 0,5 mM di CuSO4 per 3 giorni.
- Concentrare il surnatante di coltura 10 volte e dializzare contro PBS tramite un concentratore a flusso tangenziale come descritto in precedenza.
- Applicare il surnatante di coltura concentrato su una colonna contenente Sepharose con un anticorpo monoclonale anti-ICAM-1 immobilizzato covalentemente ed eluire l'ICAM-1 legato con un tampone glicina 50 mM, pH 3,0. Neutralizzare immediatamente la proteina ICAM-1 eluita con un tampone Tris 2 M, pH 8,0.
- Dializzare il materiale eluito rispetto a PBS, pH 8,0 e aggiungere il materiale dializzato a una colonna contenente agarosio Ni-NTA (acido nichel-nitriloacetico). Eluire ICAM-1 solubile con 200 mM di imidazolo, pH 8,0. Dializzare il materiale eluito con un tampone PBS, pH 8,0.
- Etichettare l'ICAM-1 purificato con l'estere Cianina5 N-idrossisuccinimide (Cy5 NHS) secondo le istruzioni del produttore.
nota: Il miglior rapporto finale-colorante/proteina è 1:1.
- Produrre frammenti di Fab da un anticorpo anti-CD107a mediante digestione della papaina e purificare i frammenti Fab mediante cromatografia a scambio ionico come descritto in precedenza. Etichettare i frammenti Fab con Alexa Fluor 568 NHS ester secondo le istruzioni del produttore.
3. Formazione di doppi strati lipidici planari supportati da vetro
- Preparare una soluzione acida di piranha fresca mescolando 140 ml di acido solforico concentrato e 60 ml di perossido di idrogeno al 30%. Lavare i vetrini coprioggetti per i vetrini di flusso immergendoli nella soluzione acida di piranha per 30 minuti. Tenere il vetrino coprioggetti in vetro con una pinza a forbice in polipropilene.
cautela: La soluzione di piranha è un ossidante estremamente forte. Ricordarsi di indossare sempre occhiali di sicurezza o una visiera integrale insieme a guanti di gomma spessi durante la manipolazione della soluzione. Lavorare solo con la soluzione piranha sotto una cappa aspirante. Evitare di riscaldarlo, trasportarlo o scuoterlo in qualsiasi momento durante l'uso, poiché potrebbe esplodere. Raccogli i rifiuti dei piranha in una bottiglia di vetro con un foro contenente piombo. Contattare il Comitato Istituzionale per la Sicurezza per il corretto utilizzo dei rifiuti.
- Sciacquare i vetrini coprioggetti lavati 7 volte con acqua ultrapura trasferendoli in sequenza in bicchieri contenenti acqua fresca. Metti da parte i vetrini coprioggetti bagnati per far scivolare via l'acqua rimanente dal vetro pulito, lasciando dietro di sé il vetro asciutto.
- In alternativa, utilizzare un puntale per pipetta collegato a una pompa a vuoto per rimuovere con cura le goccioline d'acqua rimanenti dai vetrini.
- Nella cappa sterile, eseguire diluizioni di vari lipidi per produrre la miscela di liposomi per la realizzazione di doppi strati. Innanzitutto, combinare 37 μL di liposomi DOPC e 3 μL di liposomi Biotinyl-Cap-PE. In secondo luogo, mescolare 14 μL di liposomi DOPC e 15 μL di liposomi DOGS-NTA. In terzo luogo, aggiungere 1 μl della prima miscela a 29 μl della seconda miscela per fabbricare la miscela finale di liposomi.
- Nella cappa sterile, allestire un'area di lavoro con vetrini coprioggetti asciutti nelle vicinanze. Aliquotare 2 μl della miscela di liposomi finale (vedere il passaggio 3.3) esattamente al centro di un canale di scorrimento autoadesivo. Allineare immediatamente e in modo molto preciso un vetrino coprioggetti pulito e asciutto con il vetrino e abbassare delicatamente il vetrino coprioggetti sul lato adesivo del vetrino.
- Se si prepara più di un vetrino, lavorare su un vetrino alla volta poiché la miscela di liposomi evapora rapidamente. Capovolgere il vetrino e utilizzare l'anello esterno di pinze a forbice in polipropilene per applicare una leggera pressione al contatto periferico del vetrino coprioggetti con il vetrino, assicurandosi che il vetrino sia saldamente attaccato al vetrino per evitare perdite.
nota: Non premere contro i canali del vetrino per evitare di rompere o incrinare il vetrino coprioggetti.
- Capovolgere nuovamente la diapositiva e segnare la posizione del doppio strato formato, che sembra una goccia tra il vetrino coprioggetti e il vetrino del canale, disegnando 4 punti con un pennarello indelebile attorno al doppio strato sul lato esterno del carrello del gruppo.
- Prima della prima iniezione di un liquido nel canale, designare una porta del canale come porta di ingresso e l'altra come porta di uscita e mantenere questa designazione per tutta la durata dell'esperimento.
- Per evitare la formazione di bolle, inserire l'estremità del puntale della pipetta direttamente nella porta di ingresso del canale. Riempire lentamente i canali del vetrino con 50 μl di tampone di saggio caldo (almeno a temperatura ambiente) (vedere il passaggio 1.5 per la composizione del tampone).
- Preparare una soluzione di cloruro di nichel (II) 0,5 M. Scongelare un'aliquota di 2 mL di soluzione di caseina a bagnomaria a 37 °C per 30 minuti e completarla con una soluzione di cloruro di nichel alla concentrazione finale di 200 μM.
- Lavare i doppi strati iniettando prima 100 μl della soluzione di caseina nella porta di ingresso del canale e quindi rimuovendo immediatamente 100 μl dalla porta di uscita sul vetrino mediante pipettaggio. Bloccare i doppi strati con la stessa soluzione iniettando 100 μL di soluzione di caseina nella porta di ingresso di ciascun canale e incubando il vetrino per 45 minuti a temperatura ambiente.
- Scongelare aliquote di Cy5-ICAM-1-His6 e proteine della streptavidina. Combinare le proteine nel tampone del saggio alla concentrazione finale di 2 μg/mL ciascuna. Centrifugare la soluzione per 30 minuti a 20.000 x g e 4 °C per rimuovere eventuali aggregati.
- Rimuovere il resto della soluzione bloccante dalla porta di uscita del canale del vetrino mediante pipettaggio. Iniettare 100 μL della soluzione contenente ICAM-1 e streptavidina nella porta di entrata.
- Incubare il vetrino per 45 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere l'eccesso di soluzione proteica dalla porta di uscita. Lavare il doppio strato 2 volte iniettando prima 100 μl del tampone del saggio nella porta di ingresso del canale e quindi rimuovendo immediatamente 100 μl dalla porta di uscita.
- Diluire un anticorpo anti-CD3 marcato con Alexa-Fluor-488 con il tampone del test a una concentrazione finale di 2 μg/mL. Iniettare 100 μl della soluzione anticorpale nella porta di ingresso del vetrino e incubarla per 45 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere l'eccesso di soluzione proteica dalla porta di uscita. Lavare il doppio strato 2 volte con 100 μl di tampone di saggio come al punto 3.11.
4. Imaging dell'interazione delle cellule T con il doppio strato planare
- Preriscaldare il tavolino e l'obiettivo di un microscopio confocale o a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) fino a quando la temperatura non si equilibra a 37 °C. Posizionare il vetrino con il/i bistrato/i sul tavolino riscaldato. Spostare il tavolino in una posizione appropriata in base ai segni di inchiostro e concentrarsi sul doppio strato utilizzando la fluorescenza delle molecole ICAM-1 marcate con Cy.
- Utilizzare un obiettivo 61X per il microscopio confocale o un obiettivo 100X per il microscopio TIRF, con le impostazioni del filtro appropriate.
- Per l'imaging a rilascio di granuli mediante microscopia TIRF, aggiungere frammenti Fab di anticorpi anti-CD107a marcati con Alexa-Fluor-568 alla sospensione cellulare a una concentrazione finale di 4 μg/mL prima di iniettare le cellule nelle porte di ingresso.
- Risospendere le cellule T CD4+ preparate isolate da LN PB o sangue del cordone ombelicale e iniettare 50 μl della sospensione cellulare nella porta di ingresso del canale di scorrimento contenente il doppio strato.
- Scegliere il numero di campi desiderato e registrare le immagini di ciascun campo 1 volta ogni 2 minuti per 30 minuti dopo l'iniezione.
- Sfrutta il campo luminoso, la luce riflessa e i canali fluorescenti (Alexa 488 e Cy5) del microscopio confocale per acquisire le immagini. Utilizzare la modalità TIRF per la fluorescenza Alexa-Fluor-488 e Alexa-Fluor-568 e il campo largo per la fluorescenza Cy5, nonché l'imaging in campo chiaro, sul microscopio TIRF.
