Effetto di un agente farmacologico immunomodulatore sull'interazione tra cellule dendritiche e cellule T CD4+

Abstract

Fonte: Wei, H., et al. Sviluppo e caratterizzazione funzionale di cellule dendritiche tolerogeniche mure. J. Vis. Exp. (135), (2018).

Questo video mostra un metodo per convertire le cellule dendritiche (DC) in DC tollerogeniche (TolDCs) utilizzando un agente farmacologico immunomodulatore. Questa conversione è confermata dalla valutazione della funzione di TolDC attraverso il loro effetto immunosoppressivo sulle cellule T CD4+.

Protocollo

1. Valutare la funzione dei TolDC in vitro e in vivo

1. Saggio di proliferazione singenica delle cellule T
   1. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici in autoclave ed eseguire l'esperimento in una cabina di sicurezza biologica di classe II con adeguate procedure di sicurezza.
   2. Preparare il tampone MACS utilizzando albumina sierica bovina (BSA) allo 0,5% e 2 mM di EDTA in 500 ml di PBS. Sterilizzare il tampone filtrandolo attraverso un filtro da 0,2 μm.
      nota: Mantieni il tampone sul ghiaccio durante l'esperimento successivo.
   3. Per ottenere le cellule T CD4+, sopprimere i topi transgenici del recettore delle cellule T (TCR) OT-II di 8-10 settimane di età utilizzando una camera di CO₂. Posizionare il mouse su una tavola da dissezione e risciacquare con etanolo al 70%. Isolare la milza dal lato sinistro dell'addome usando forbici chirurgiche e pinze.
   4. Mettere la milza con 2 ml di PBS in una piastra di coltura di 6 cm e utilizzare il dorso dell'asta di una siringa da 3 ml per tritare la milza passando un colino cellulare da 40 μm.
   5. Raccogliere la sospensione cellulare e centrifugare a 300 x g per 5 minuti.
   6. Risospendere il pellet della cella in 400 μl di tampone MACS.
   7. Aggiungere 100 μl di cocktail di biotina-anticorpi delle cellule T CD4+ a 4°C per 5 mins.
      nota: Il cocktail di anticorpi si lega ad altri tipi di cellule, ad eccezione delle cellule T CD4+, come CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, Anti-MHC classe II, Ter-119 e TCRγ/δ.
   8. Aggiungere 300 μl di tampone MACS e 200 μl di perle Anti-Biotina (Tabella dei Materiali) a 4°C per 10 minuti.
   9. Posizionare la colonna composta da sfere ferromagnetiche (Tabella dei materiali) e filtro di pre-separazione insieme nel campo magnetico e risciacquarla con 3 ml di tampone MACS.
   10. Aggiungere 9 ml di tampone MACS nelle cellule e centrifugare a 300 x g per 5 minuti.
   11. Risospendere il pellet cellulare in 3 ml di tampone MACS e applicarlo sulla colonna. Raccogliere le cellule T CD4+ contenenti il flusso continuo.
   12. Lavare la colonna con altri 3 ml di tampone MACS e raccogliere anche il flusso.
   13. Per ottenere le DC pan spleniche, sopprimere i topi C57BL/6 di 8-10 settimane di età utilizzando una camera di CO₂. Posizionare il mouse su una tavola da dissezione e risciacquare con etanolo al 70%. Isolare la milza dal lato sinistro dell'addome usando forbici chirurgiche e pinze. Mettere la milza in un piatto di coltura di 6 cm contenente 2 ml di soluzione di collagenasi D (2 mg/ml di collagenasi D disciolta in HBSS contenente calcio e magnesio).
   14. Iniettare 1 ml di soluzione di collagenasi D nella milza due volte con una siringa da 1 ml e un ago da 25G. Tagliate la milza a pezzetti con delle forbicine.
   15. Agitare e incubare a temperatura ambiente per 25 minuti.
   16. Aggiungere 500 μl di EDTA 0,5 M a temperatura ambiente per 5 minuti.
       nota: I passaggi da 1.1.13 a 1.1.14 sono fondamentali per aumentare la resa dei centri di distribuzione.
   17. A questo punto, utilizzare il dorso dello spingipezzo della siringa da 3 ml per tritare l'impasto di milza passando un colino cellulare da 40 μm e raccogliere la sospensione cellulare centrifugando a 300 x g per 5 minuti.
   18. Risospendere il pellet cellulare in 350 μl di tampone MACS, 50 μl di reagente bloccante FcR e 100 μl di cocktail di biotina-anticorpi a cellule dendritiche Pan a 4°C per 10 minuti.
       nota: Il cocktail di anticorpi contro gli antigeni che non sono espressi dalle DC.
   19. Lavare le cellule aggiungendo 9 ml di tampone MACS e centrifugare a 300 x g per 5 minuti.
   20. Risospendere il pellet cellulare in 800 μl di tampone MACS e aggiungere 200 μl di sfere di Anti-Biotina a 4°C per 10 minuti.
   21. Ripetere i passaggi da 1.1.9 a 1.1.11 per raccogliere i controller di dominio.
   22. Lavare la colonna con altri 3 ml di tampone MACS due volte e raccogliere anche il flusso.
   23. Trattare i 2 x 10⁵ DC/ml in presenza o assenza di 100-400 nM CDDO-DFPA a 37°C per 1 ora. Separatamente, etichettare le cellule T CD4+ (1 x 10⁷/ml) con 1 μM di CFSE a 37°C per 15 minuti, lavare con PBS e regolare nuovamente il volume per ottenere la concentrazione finale a 2 x 10⁶ cellule T/ml.
   24. Successivamente, in una piastra a 96 pozzetti, co-coltivare 100 μl delle cellule dendritiche trattate con lo stesso volume di cellule T CD4+ marcate con CFSE, entrambe raccolte dai passaggi precedenti per ottenere un rapporto 1:10. Aggiungere ora 100 ng/mL di peptide di ovoalbumina (OVA) 323-329 per pozzetto e misurare l'intensità CFSE delle cellule T mediante citometria a flusso dopo 2-3 giorni di incubazione.
       nota: Il numero di cellule e il rapporto tra DC e cellule T sono stati ottimizzati dal nostro lavoro precedente.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
CDDO-DFPA (RTA-408)	Reata Pharmaceuticals	Sintesi interna	Coltura cellulare
Mouse GM-CSF	Peprotech Inc	315-03	Differenziazione BMDC
Kit di isolamento per cellule dendritiche Pan	Miltenyi Biotec Inc.	130-100-875	Saggio di proliferazione delle cellule T
Cocktail di biotina-anticorpi a cellule dendritiche Pan	Miltenyi Biotec Inc.	130-100-875	Saggio di proliferazione delle cellule T
Kit di isolamento delle cellule T CD4+	Miltenyi Biotec Inc	130-104-454	Saggio di proliferazione delle cellule T
CFSE	BioLeggenda	423801	Saggio di proliferazione delle cellule T
Reagente bloccante FcR	Miltenyi Biotec Inc.	130-100-875	Saggio di proliferazione delle cellule T
Microsfere anti-biotina	Miltenyi Biotec Inc.	130-104-454	Saggio di proliferazione delle cellule T
Siringa da 1 ml	BD Bioscienze	309626	Saggio di proliferazione delle cellule T
Bsa	Sigma Aldrich Inc	Codice: A2058	Saggio di proliferazione delle cellule T
Edta	ThermoFisher Scientifico	15575020	Saggio di proliferazione delle cellule T
Colonna LS	Miltenyi Biotec Inc.	Codice 130-042-401	Saggio di proliferazione delle cellule T
Filtro di pre-separazione	Miltenyi Biotec Inc	Codice 130-095-823	Saggio di proliferazione delle cellule T
Collagenasi D	Sigma Aldrich Inc.	11088858001	Saggio di proliferazione delle cellule T
S.b.B	ThermoFisher Scientifico	14025076	Saggio di proliferazione delle cellule T
Peptide dell'ovoalbumina (OVA) 323-329	Sigma Aldrich Inc.	O1641	Saggio di proliferazione delle cellule T