Una tecnica in vitro per visualizzare l'esocitosi dei granuli secretori nei mastociti

Abstract

Fonte: Klein, O., et al. Imaging FITC-destrano come reporter per esocitosi regolata J. Vis. Exp. (2018).

Questo video mostra una tecnica per visualizzare l'esocitosi nei mastociti. Le cellule sono incubate con FITC-destrano, un reporter fluorescente, che viene assorbito dalle cellule all'interno di granuli secretori (SG), dove il pH acido spegne la sua fluorescenza. Dopo la stimolazione dell'esocitosi dei granuli, il pH più elevato del mezzo induce la fluorescenza reporter all'interno degli SG fusi, che viene visualizzata utilizzando un microscopio a fluorescenza.

Protocollo

1. Preparativi

1. Preparazione di terreni di coltura RBL (linea di mastociti RBL-2H3)
   1. Mescolare 500 mL di terreno di Eagle's modificato a basso contenuto di glucosio di Dulbecco (DMEM) con 56 mL di siero fetale bovino (FBS), 5,5 mL di soluzione di penicillina-streptomicina-nistatina, 5,5 mL di soluzione di L-Glutammina 200 mM. Ciò si traduce in DMEM a basso contenuto di glucosio integrato con il 10% di FBS, 100 μg/mL di streptomicina, 100 unità/mL di penicillina, 12 unità/mL di nistatina e 2 mM di L-glutammina.
   2. Filtrare il substrato utilizzando un filtro a vuoto dall'alto con pori di 0,22 μm e conservare a 4 °C.
2. Manutenzione delle cellule RBL.
   1. Far crescere le cellule RBL fino a una confluenza massima del 90% in un piatto di 10 cm. Se la coltura cellulare è sana, le cellule dovrebbero avere una forma a fuso con sporgenze occasionali.
   2. Per la scissione cellulare, staccare le cellule dalla piastra aspirando il terreno e sostituendolo con 2 mL di soluzione di tripsina/EDTA B. Incubare per 5-10 minuti in un'atmosfera umidificata al 5% di CO₂ a 37 °C.
   3. Una volta che le cellule si sono staccate, neutralizzare la tripsina aggiungendo 2 mL di terreno di coltura, utilizzando una pipetta, e dividere le cellule in un rapporto 1:2 - 1:10.
3. Preparazione di 20x tampone di Tyrode
   1. Preparare una soluzione madre 20x di 54 mM di KCl, 20 mM di MgCl₂, 2,74 M di NaCl e 8 mM di NaH₂PO₄ in acqua bidistillata (DDW). Mescolare bene e conservare a 4 °C.

2. Coltura di cellule RBL per microscopia di cellule vive

1. Preparazione della soluzione di FITC-destrano.
   1. Miscelare 1 mg di polvere di isotiocianato di fluoresceina (FITC)-destrano (150 K) per 1 mL di terreno di coltura (vedere passaggio 1.1.1). Per un bicchiere di copertura a camera piena, preparare 3 ml.
   2. Utilizzando un'unità filtrante per siringa in acetato di cellulosa con pori di 0,22 μm, filtrare il FITC-destrano disciolto.
   3. Aggiungere immunoglobulina E (IgE) di topo a una concentrazione di 1 μg/mL.
2. Semina di cellule RBL per l'imaging
   1. Il giorno prima dell'imaging, aspirare il terreno dalla piastra di coltura e sostituirlo con 2 mL di soluzione di tripsina/acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) B. Incubare per 5 - 10 minuti in un'atmosfera umidificata al 5% di CO₂ a 37 °C. Una volta che le cellule si sono staccate, neutralizzare la tripsina aggiungendo 2 mL di terreno di coltura.
   2. Contare le cellule RBL utilizzando un emocitometro e regolare il volume di conseguenza con i terreni di coltura per ottenere una concentrazione cellulare di 7,5 x 10⁵/mL.
   3. Aggiungere 10 μl della sospensione cellulare a un bicchiere di copertura a camera pre-riempito con terreni di coltura freschi integrati con FITC-destrano (ciò si traduce nella semina di 7,5 x 10³ cellule in una camera).
   4. Coltivare cellule RBL durante la notte in un'atmosfera umificata del 5% di CO₂ a 37 °C. Le cellule devono rimanere a un livello sub-confluente per assicurarsi che le cellule siano separate e che sia facile identificare ogni singola cellula al microscopio.
3. Trasfezione di cellule RBL - opzionale.
   1. Per l'imaging di eventi esocitici in combinazione con altre proteine marcate in fluorescenza, vedere il protocollo di trasfezione per le cellule RBL in Azouz et al.

3. Microscopia su cellule vive dell'esocitosi

1. Preparazione delle soluzioni:
   1. Preparare una soluzione tampone finale di Tyrode diluendo la soluzione madre in DDW in una diluizione 1:20 e integrare con 20 mM di Hepes pH 7, 1,8 mM di CaCl₂, 1 mg/mL di albumina sierica bovina (BSA) e 5,6 mM di glucosio.
   2. Preparare appena un reagente secretagogo 20x nel tampone di Tyrode [1 μg/mL di dinitrofenile coniugato all'albumina sierica umana (DNP-HAS (Ag)) nel nostro caso, per una concentrazione di 50 ng/mL 1x].
   3. Preparare una soluzione di cloruro di ammonio 400 mM sciogliendo la polvere nel tampone di Tyrode.
2. Preparazione delle cellule.
   1. Lavare il coverglass a camera 3 volte aspirando il fluido dalla camera e riempiendolo nuovamente con 300 μl di tampone Tyrode, preriscaldato a 37 °C. Infine, riempire la camera con 300 μl di tampone di Tyrode, preriscaldato a 37 °C.
   2. Posizionare il vetro di copertura a camera nella camera dell'incubatrice del microscopio. Assicurarsi che la camera sia stabile.
3. Impostazione del microscopio
   1. Per scegliere una regione di interesse da tracciare, accendere la sorgente luminosa fluorescente (tradizionalmente una lampada al mercurio) e scegliere il filtro di fluorescenza appropriato (scegliere il filtro per i fluorofori verdi per la visualizzazione del FITC-destrano). Una volta che la regione di interesse è a fuoco e si trova al centro del campo visivo, spegnere la fonte di luce per evitare il fotosbiancamento e la tossicità.
      NOTA: Parte del FITC-destrano incorporato nelle cellule può mantenere la fluorescenza. Questo perché il FITC-destrano può anche essere smistato in compartimenti non lisosomiali come gli endosomi.
   2. Accendere l'illuminazione appropriata per l'eccitazione FITC. Se si utilizza un microscopio laser, accendere il laser a 488 nm. L'emissione dovrebbe essere raccolta intorno a 500 - 550 nm (picchi di emissione FITC a 510 - 520 nm).
   3. Quando si utilizza un microscopio confocale, aprire al massimo il foro stenopeico. Ciò consentirà l'uso di una potenza laser inferiore per evitare lo sbiancamento e la tossicità e garantirà la cattura degli eventi di esocitosi da tutti i piani della cellula.
   4. Calibrare l'intervallo di tempo tra le acquisizioni di immagini.
      1. Cellule diverse possono variare nella loro cinetica di esocitosi regolata. Per l'imaging specifico dell'esocitosi composta, si consiglia un intervallo di tempo di almeno 5 secondi. Tuttavia, come regola generale, per consentire un imaging veloce, assicurarsi che il tempo di acquisizione di un singolo fotogramma sia veloce.
      2. Quando si utilizza un microscopio confocale a scansione laser, impostare la direzione di scansione su bidirezionale, non consentire la media e impostare la risoluzione su 512 x 512 (consigliato; le ultime due disposizioni aiuteranno anche a ridurre al minimo lo sbiancamento e la tossicità).
4. Imaging dell'esocitosi.
   1. Visualizzare le celle per la durata desiderata, a seconda del tipo di cellula o secretagogo. Nelle cellule RBL attivate con IgE/Ag, la maggior parte degli eventi esocitici si verifica entro 15-20 minuti dall'attivazione.
   2. Per l'attivazione delle cellule, aggiungere 16 μl dalla soluzione secretagoga 20x alla camera.
5. Conferma della presenza di FITC-destrano nelle cellule.
   1. Per confermare la presenza e la localizzazione del FITC-destrano agli SG, aggiungere delicatamente 16 μL di soluzione di cloruro di ammonio (fare attenzione a non muovere la camera per non perdere la messa a fuoco) nella camera (questo farà una concentrazione finale di 20 mM). Ciò indurrà l'alcalinizzazione degli SG e l'estinzione della fluorescenza FITC, che avverrà in pochi secondi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM a basso contenuto di glucosio	Induzioni Biologiche	01-050-1A
Siero fetale bovino	Gibco	Codice: 12657
Soluzione di penna-streptococco-nistatina	Induzioni Biologiche	03-032-1B
Soluzione di L-Glutammina 200 mM	Induzioni Biologiche	03-020-1A
FITC destrano 150K	Sigma-Aldrich	46946-500MG-F
Soluzione B di tripsina/EDTA	Induzioni Biologiche	03-052-1A	Scaldare a bagnomaria a 37 °C prima dell'uso
Filtro per vuoto dall'alto con pori di 0,22 μm	Sigma-Aldrich	CLS430769-1EA
Unità filtrante per siringa in acetato di cellulosa, pori di 0,22 μm	Sartorius	Codice 16534K
Vetro di copertura a camera	Termo scientifico	155411
Piastre di coltura trattate con coltura tissutale Corning	Sigma-Aldrich	CLS430167
Albumina sierica bovina	Sigma-Aldrich	Codice: A4503
IgE monoclonali anti-DNP	Sigma-Aldrich	D8406
DNP-HSA (Ag)	Sigma-Aldrich	Codice: A6661	Evitare l'esposizione diretta alla luce
tampone Hepes 1M, pH 7,4	Induzioni Biologiche	03-025-1B
CaCl2	Merk	102382
glucosio	Laboratori BDH	Codice 284515V
Cloruro di ammonio	Merk	Codice: 1145
TUBI sale dipotassico	Sigma-Aldrich	Codice 108321-27-3
Acetato di calcio idrato	Sigma-Aldrich	Codice 114460-21-8
Acetato di magnesio tetraidrato	Sigma-Aldrich	Codice: M5661
Glutammato di potassio (acido L-glutammico, sale di potassio monoidrato)	Sigma-Aldrich	G1501
NaH2PO4	Merk	Codice 6346
NaCl	Merk	106404
MgCl2	Merk	105833
Kcl	Merk	104936
Elettroporatore	BTX	ECM830
Microscopio confocale, Zeiss	Zeiss	LSM 5 Pascal, Axiovert 200M	Utilizzato nella Figura 3. Dotato di un sistema elettronico a temperatura controllata
incubatore ad aria compressa
Microscopio confocale, Zeiss	Zeiss	LSM 800, Axio Observer.Z1 /7	Utilizzato nella Figura 2. Dotato di un rivelatore GaAsP e di un sensore elettronico a temperatura controllata
incubatore ad aria compressa
Microscopio confocale, Leica	Leica	SP5	Utilizzato nella Figura 1. Dotato di un rivelatore Leica HyD e di un incubatore di primo livello (okolab)
Celle RBL-2H3			Le cellule RBL-2H3 sono state clonate nel laboratorio di Reuben P. Siraganian. Vedi riferimento 67