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1. Coniugazione dell'antigene proteico con il lipide PEGilato
- Aggiungere 3 g di perle di gel di destrano reticolato con un intervallo di frazionamento di 1.500-30.000 Dalton (Da) a un pallone sottovuoto da 250 ml. Aggiungere 60 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e mescolare continuamente con un'ancoretta magnetica. Sigillare il pallone e fissarlo a un vuoto per avviare il degasaggio su una piastra di agitazione per almeno 1 ora.
- In una colonna per cromatografia in vetro da 1,0 cm x 30 cm con il tappo di rotazione chiuso, aggiungere PBS alla colonna da lavare. Aprire il tappo di rotazione e svuotare la colonna. Dopo il lavaggio, aggiungere alla colonna l'impasto liquido delle perle degassate. Aggiungere continuamente l'impasto fino a quando la colonna non è impaccata a un'altezza del cordone di circa 24 cm.
- Una volta che la colonna ha una "testa" di circa 4-5 cm di PBS sopra le perline impacchettate, prepara i seguenti passaggi.
- Crea un sifone a flusso di gravità misurando un pezzo di tubo abbastanza lungo da raggiungere un ripiano di 1-2 piedi sopra la parte superiore della colonna e crea un anello che scende vicino alla parte inferiore della colonna e ritorna in cima alla colonna. Aggiungere un tappo di rotazione a un'estremità del tubo, lasciando aperto un lato del tubo. Posizionare l'estremità aperta della provetta in un flacone da 500 ml di PBS e posizionarla sul ripiano sopra la colonna.
- Prendere l'estremità con il tappo di rotazione e collegare una siringa da 10 ml. Aprire la valvola di arresto del turnover sulla linea del tubo e aspirare il PBS attraverso il tubo. Una volta che il PBS ha raggiunto i tre quarti del percorso attraverso il tubo, rimuovere rapidamente la siringa e aggiungere il tappo di rotazione nella parte superiore della colonna: il liquido dovrebbe scorrere sulla colonna.
NOTA: La quantità di "testa" di PBS rimasta sulla parte superiore della colonna deve essere compresa tra 1 e 3 cm. La quantità minima per lavare la colonna è di 3 volumi di colonna.
- Determinare la quantità di proteine (moli) da legare ai lipidi in base al suo peso molecolare (MW).
NOTA: Il frammento Fab dell'immunoglobulina anti-topo di capra, IgM (a sua volta una IgG) viene utilizzato qui come antigene surrogato universale per la stimolazione policlonale delle cellule B. Di conseguenza, il frammento Fab di IgG di capra ha un MW di circa 48 kiloDalton (kDa) ed è disponibile in commercio in una quantità totale di 1,3 mg. Pertanto, la quantità di proteine da collegare è di 27,1 μmol.
- Determinare il coefficiente di estinzione della proteina di interesse. Se non è noto, misurare l'assorbanza proteica a 280 nm utilizzando uno spettrofotometro e dividere il valore di A280 per il numero di moli calcolato al punto 1.4.
NOTA: Il coefficiente di estinzione di Fab di IgG di capra a 280 nm è 64.600 M-1.
- Per garantire la rimozione di tracce del tampone contenente ammina, desalinizzare la proteina sulla colonna creata nei passaggi 1.1-1.3 e raccogliere le frazioni proteiche in provette da microcentrifuga da 1,5 ml (~500 μl per frazione).
- Chiudere la valvola di arresto del turnover collegata alla parte superiore della colonna e rimuovere la parte superiore della colonna. Se non è già aperto, aprire la valvola di arresto del ricambio nella parte inferiore della colonna e attendere che la "testa" del PBS colpisca la parte superiore delle perline.
- Aggiungere lentamente la proteina di interesse alla parte superiore delle perline utilizzando una pipetta di vetro Pasteur, facendo attenzione a ridurre al minimo il disturbo alla parte superiore delle perline.
- Una volta che la "testa" della soluzione proteica ha raggiunto la parte superiore delle sfere, aggiungere delicatamente 1 mL di PBS tramite una pipetta Pasteur. Ripeti tre volte. Aggiungere PBS per creare una testa di 4-5 cm e ripetere il passaggio 1.3 per lavare la colonna.
NOTA: Questo passaggio può essere saltato se si è certi che non è presente alcun tampone contenente ammina.
- Determinare le frazioni che contengono proteine misurando i valori A280 e raggruppare le frazioni che danno circa il 90% di recupero della proteina.
NOTA: Questo in genere diluisce la proteina di 1,5-2 volte. Determinare la concentrazione proteica dopo il pooling. Concentrare la proteina in questa fase, se necessario, utilizzando un concentratore per centrifugazione.
- Aggiungere 2,5 molari equivalenti del reticolante eterobifunzionale alla proteina.
- Innanzitutto, pesare circa 5 mg di succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato (SPDP, MW = 314 g/mol) in una provetta da microcentrifuga. Per determinare il volume per dissolvere l'SPDP, moltiplicare la concentrazione di proteina molare e 250x per generare una soluzione 100x che darà un eccesso di 2,5 molari nella reazione.
NOTA: Ad esempio, se la concentrazione proteica è di 50 μM, è necessaria una soluzione di SPDP a 12,5 mM. Per 5 mg di SPDP, ciò corrisponde a 1,27 mL di dimetilsolfossido (DMSO).
- Aggiungere SPDP alla proteina di interesse con una diluizione 1:100. Porre la reazione su un agitatore oscillante a temperatura ambiente (RT) per circa 1 ora.
- Per rimuovere l'eccesso di SPDP e proteggere i legami disolfuro endogeni nella proteina nella successiva fase di riduzione, equilibrare e lavare la colonna creata nei passaggi 1.1-1.3 in 100 mM di acetato di sodio (NaOAc) a pH 5,5 o creare una colonna identica esclusivamente per l'uso in questo tampone.
- Dopo 1 ora di incubazione con SPDP, desalinizzare la proteina sulla colonna bilanciata in 100 mM di NaOAc. Eseguire questo passaggio in modo identico al passaggio 1.6, tranne che per l'utilizzo di 100 mM di NaOAc (pH 5,5) come eluente. Raccogli le frazioni, determina l'A280 e raggruppa le frazioni superiori. Lavare la colonna in PBS.
- Preparare una soluzione di 2,5 M di DTT (MW = 154 g/mol) in acqua bidistillata (ddH2O). Aggiungere 25 mM di DTT alle frazioni aggregate di proteine per 5-10 minuti.
- Misura l'A280 della proteina e dividilo per il coefficiente di estinzione. Inoltre, determina l'A343. Calcola il rapporto di legame in base alla molarità della proteina (A280) e del linker (A343).
NOTA: Disattivare la calibrazione automatica dell'A340 se si utilizza uno spettrofotometro nanodrop. La misura A343 rappresenta l'assorbanza del gruppo piridina 2-tione (coefficiente di estinzione = 7550 M-1) che viene rimosso dal reticolante SPDP dal DTT. Un rapporto molare tra linker/proteina di 1,2-1,5 si ottiene generalmente quando si esegue la reazione con un eccesso di 2,5 molari di SDPD su un'ampia gamma di proteine.
- Eseguire le frazioni raggruppate sulla colonna lavata in PBS come descritto in precedenza. Raccogli le frazioni, determina l'A280 e raggruppa le frazioni superiori. Determinare la concentrazione di proteine con A280 dopo aver raggruppato le frazioni.
- Preparare DSPE-PEG(2000)-Maleimmide (1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilenglicole)-2000)-Maleimmide. Questo verrà aggiunto alla proteina con un rapporto molare di 10:1. Preparare un brodo 100x di DSPE-PEG(2000)-Maleimide per ottenere la concentrazione desiderata.
- Ad esempio, se la concentrazione proteica è di 10 μM dopo il passaggio 1.14, preparare una riserva di DSPE-PEG(2000)-Maleimmide a 10 mM. Pesare attentamente DSPE-PEG(2000)-Maleimide (MW = 3000 g/mol) e aggiungere la quantità appropriata di DMSO. Più cicli di vortice delicato e sonicazione possono farlo sciogliere completamente.
- Determinare il volume totale delle frazioni dal punto 1.14 e trasferire con cura la soluzione in un piccolo pallone a fondo rotondo (RBF) (10-25 mL). Aggiungere la quantità appropriata di 100x DSPE-PEG(2000)-Maleimide alla proteina per ottenere una concentrazione finale in eccesso molare di 1x, 10 volte. Agitare delicatamente la soluzione per assicurarsi che il DMSO sia completamente disperso.
- Eseguire la reazione durante la notte sotto azoto in un RBF sigillato. Usa un setto di gomma e mettilo in una cappa aspirante.
- Rimuovere l'atmosfera perforando il setto con un ago da 20 G collegato a una siringa da 3 ml all'estremità del tubo collegato a un vuoto e accendere il vuoto per 3-5 s.
- Sostituisci l'atmosfera con l'azoto. Riempire un palloncino collegato a una siringa da 3 ml tagliata a metà con azoto e inserire un ago da 20 G. Forare il setto per riempire di azoto l'atmosfera all'interno del pallone a fondo tondo. Ripetere ancora una volta la rimozione dell'atmosfera e la sostituzione con azoto e lasciare il palloncino di azoto attaccato per una notte.
- Preparare una colonna separata di perle di gel di destrano reticolato con un intervallo di frazionamento compreso tra 4.000 e 150.000 Da in una colonna per cromatografia in vetro da 1,0 cm x 50 cm (secondo i passaggi 1.1-1.3).
- Il giorno seguente, rimuovere la proteina dal pallone a fondo tondo preparato al punto 1.17 e passarlo (seguendo il metodo utilizzato al punto 1.6) sulla colonna di perle di gel di destrano reticolato (dal passaggio 1.18).
NOTA: La quantità totale da caricare sulla colonna non deve essere superiore a 2 ml. Se è stata utilizzata una reazione più grande, dividere in due ed eseguire su colonne separate o eseguire su una colonna di diametro maggiore.
- Raccogli le frazioni, determina l'A280, raggruppa le frazioni superiori e determina la concentrazione di proteine. La presenza del lipide non influirà sulle misurazioni.
- Conservare le frazioni finali raggruppate di proteine legate ai lipidi a 4 °C fino al momento dell'uso.
2. Preparazione dei liposomi
- Pesare i lipidi: DSPE-PEG(2000) (1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilenglicole)-2000, MW = 2805,5 g/mol; Colesterolo (3b-idrossi-5-colestene, 5-colesten-3b-olo), MW = 386,7 g/mol; e DSPC (1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina), MW = 790,1 g/mol. Creare una soluzione da 5 mg/mL di DSPC, una soluzione da 4 mg/mL di colesterolo e una soluzione da 2 mg/mL di DSPE-PEG(2000) in cloroformio.
- Assicurarsi che il rapporto molare dei lipidi nei liposomi sia: 57% DSPC, 38% colesterolo e 5% DSPE-PEG (2000), come rappresentato nella Tabella 1.
NOTA: È importante controllare la quantità di antigene sul liposoma, che generalmente varia dallo 0,01 allo 0,1%. Nella Tabella 1 viene utilizzato lo 0,1% del frammento di IgM Fab anti-topo di capra legato al lipide PEGilato. È fondamentale prendere in considerazione l'eccesso molare di 10 volte di DSPE-PEG(2000)-Maleimide che è stato aggiunto alla proteina nel passaggio 1.15, per garantire che la quantità totale di lipidi PEGilati non superi il 5%.
- Considerare le quantità finali di lipidi (μmol) quando si creano lipidi per l'estrusione. Vedere la Tabella 1 per un esempio di calcolo delle concentrazioni di lipidi molari per la creazione di liposomi a una concentrazione lipidica totale di 1,25 μM.
- Una volta calcolata la quantità corretta di ciascun lipide da sommare, unire il tutto in una provetta in vetro borosilicato da 12 mL.
- Soffiare via con cura il cloroformio.
- Utilizzare il tubo e una siringa da 3 ml con un ago, preparato al punto 1.17.1, per soffiare accuratamente il cloroformio nel tubo con azoto. Soffiare delicatamente un flusso di azoto sulla soluzione mentre si ruota il tubo con l'altra mano. Fare attenzione a ridurre al minimo gli schizzi o a far scorrere il liquido lungo il lato del tubo poiché potrebbe essere più difficile trasformarlo in soluzione nel passaggio successivo.
- Aggiungere 100 μl di DMSO a ciascuna provetta e liofilizzare questa soluzione durante la notte. Coprire la parte superiore della provetta con una salvietta da laboratorio non statica, fissarla con un elastico e congelare a -80 °C.
3. Estrusione di liposomi
- Aggiungere 1 mL di PBS contenente la proteina legata ai lipidi alla provetta da 12 mL contenente i lipidi. Sonicare la soluzione per circa 30 secondi a 1 minuto in un bagno d'acqua di sonicazione. Riposa per 5 minuti o più tra un giro e l'altro e ripeti 3-4 volte.
- Preparare un estrusore come indicato dal produttore.
- Aggiungere i supporti del filtro al supporto della membrana interna e posizionare alcune gocce (10 μL ciascuna) di PBS su un film di paraffina. Usando una pinzetta, afferrare un bordo del supporto del filtro e immergerlo nella goccia da 10 μl.
- Posizionare il filtro all'interno dell'O-ring. Fallo per entrambe le parti. Usando una pinzetta, prendi un filtro da 0,8 μm sul bordo, immergilo nella goccia da 10 μl e ricopri l'esterno dell'O-ring con PBS. Posizionare delicatamente il filtro da 0,8 μm sull'O-ring in modo che il filtro non sporga dal supporto interno della membrana.
- Posizionare il blocco riscaldante dell'estrusore su una piastra calda per preriscaldare l'estrusore. Accendere la piastra riscaldante al minimo e lasciare che il blocco riscaldante dell'estrusore raggiunga la temperatura desiderata. Per evitare potenziali problemi con l'aggregazione proteica, non riscaldare il blocco oltre i 37 °C.
- Caricare il campione sonicato in una delle siringhe di estrusione inserite nell'estrusore. Posizionare la siringa dell'estrusore nell'altra estremità dell'estrusore. Assicurarsi che lo stantuffo della siringa vuoto sia impostato su zero. La siringa vuota si riempirà man mano che il lipide viene estruso attraverso la membrana in policarbonato da 0,8 μm. Cerca di evitare di far passare le bolle avanti e indietro attraverso la membrana.
- Posizionare l'estrusore completamente assemblato nel blocco riscaldante. Spingere delicatamente lo stantuffo della siringa piena di lipidi verso la siringa vuota. A seconda della concentrazione lipidica, questo sarà difficile da superare. Ripeti 20 volte.
- Rimuovere l'estrusore completamente assemblato dal blocco riscaldante. Rimuovere lentamente la siringa piena dall'estrusore, assicurarsi di raccogliere eventuali lipidi che potrebbero fuoriuscire durante la rimozione. Metti i liposomi in una fiala pulita. Ripetere i passaggi da 3.4 a 3.6 utilizzando membrane in policarbonato da 0,2 μm e 0,1 μm.
- Creare una colonna di perle di agarosio reticolata2 di 0,7 x 50 cm con un intervallo di separazione di 0,7-10 Mega Dalton (MDa) bilanciata in PBS. Aggiungere i liposomi ed eseguire come al passaggio 1.6. Le frazioni contenenti liposomi avranno una ridotta trasmissione della luce nell'intervallo 250-400 nm.
- Conservare i liposomi a 4 °C e non congelarli.
4. Flusso di calcio per monitorare l'attivazione delle cellule B da parte dei liposomi antigenici
- Eutanasia dei topi mediante overdose di anidride carbonica (CO2) o isoflurano, secondo le procedure operative standard istituzionali. Confermare l'eutanasia dei topi mediante lussazione cervicale.
- Sterilizzare gli strumenti chirurgici e la carcassa del topo utilizzando il 70% di etanolo. Utilizzare una pinza a iride curva lunga 10 cm, con punta da 0,8 mm, per separare la pelle che copre la cavità toracica dalla gabbia toracica. Utilizzare forbici da dissezione diritte lunghe 10 cm per praticare un'incisione distale con un'incisione bilaterale.
- Usa una pinza per iride curva e forbici da dissezione per estrarre la milza dalla cavità addominale. Rimuovere il tessuto adiposo che circonda la milza e quindi metterlo in una provetta conica di polistirene da 15 ml riempita con RPMI1640 terreno contenente l'1% di siero fetale di vitello (FCS) e penicillina-streptomicina.
- Trasferire la milza e il terreno su un filtro cellulare da 40 μm montato su una provetta conica da 50 mL. Utilizzando l'estremità in gomma di uno stantuffo per siringa da 3 ml, schiacciare delicatamente la milza. Lavare il filtro cellulare da 40 μm con il fluido. Ripetere questo processo fino a quando non rimane solo il tessuto adiposo nel filtro cellulare da 40 μm. Sciacquare il setaccio con 3-5 ml di terreno per aumentare il recupero cellulare.
- Centrifugare l'omogeneizzato di cella a 300 x g per 5 minuti a RT. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e aggiungere 10 mL di tampone di lisi 1x RBC al pellet. Pipettare su e giù, lasciare agire per 2-3 minuti a RT e quindi centrifugare a 300 x g per 5 minuti a RT.
- Scartare il surnatante e risospendere gli splenociti impoveriti di globuli rossi in 10 ml di terreno. Determinare il numero totale di cellule utilizzando un emocitometro o un altro dispositivo di conteggio delle cellule. Pellettare le celle mediante centrifugazione come descritto sopra.
NOTA: La concentrazione finale ideale necessaria per il carico di Indo-1 degli splennociti è 10-20 x 106 cellule/mL, ma può essere utilizzata una concentrazione inferiore di cellule.
- Risospendere gli splenociti a 15 x 106 cellule/mL in tampone di carico del flusso di calcio (Roswell Park Memorial Institute, RPMI1640 terreno contenente l'1% di FCS, 10mM di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico (HEPES), 1mM di cloruro di magnesio (MgCl2), 1mM di glicole etilenico-bis(β-amminoetil etere)-N, N,N', N', acido N'-tetraacetico (EGTA) e 5% di penicillina-streptomicina). Aggiungere 1,5 μM di Indo-1 da una soluzione stock di DMSO da 1 mM e capovolgere la provetta più volte per miscelare. Proteggere dalla luce e incubare le cellule a bagnomaria a 37 °C per 30 minuti.
- Dopo l'incubazione di 30 minuti, aggiungere 5 volte la quantità di tampone di caricamento del flusso di calcio. Centrifugare a 300 x g per 7 min a RT.
- Per il gating su cellule B, colorare le cellule con CD5-PE anti-topo 1:200 e B220-PE/Cy7 anti-topo in 0,5 mL di tampone di caricamento a 4 °C per 20 min, al riparo dalla luce.
- Lavare gli splenociti in un tampone di carico del flusso di calcio e centrifugare a 300 x g per 7 minuti a RT. Risospendere le cellule a 10-20 x 106 cellule/mL in un tampone di flusso di calcio (soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) contenente l'1% di FCS, 1 mM di MgCl2 e 1 mM di cloruro di calcio (CaCl2)). Conservare in ghiaccio, al riparo dalla luce fino al momento dell'uso sul citometro a flusso.
- Impostare la citometria a flusso con controlli a colorazione singola e non colorata per la compensazione.
- Far scorrere le celle colorate per impostare i cancelli in modo appropriato (vedere la Figura 1A). Impostare il grafico Indo-1 (viola) rispetto a Indo-1 (blu), regolare le tensioni nei canali Indo-1 per posizionare le cellule colorate con una pendenza di 45-60° per massimizzare il rapporto segnale: rumore del viola Indo-1: variazione blu del rapporto a seguito della stimolazione delle cellule B.
NOTA: Assicurarsi che le tensioni non siano troppo alte, in modo tale che una percentuale significativa delle celle (>5%) si trovi contro la parte superiore del grafico.
- Crea un gate diagonale che incapsula la parte in alto a sinistra (Viola+Blu-) del grafico, in modo tale che senza stimolazione il <10% delle cellule si trovi nel gate, che dovrebbe idealmente aumentare fino al >75% dopo la stimolazione.
- Aggiungere 0,5 mL di cellule a una provetta di polistirene a fondo tondo da 5 mL tappata (provetta per smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS)) e riscaldare le cellule a 37 °C per 3-5 minuti a bagnomaria. Posizionare il tubo FACS nella camera a camicia d'acqua a 37 °C collegata a un bagno d'acqua di ricircolo.
- Far scorrere la provetta nella camicia d'acqua del citometro a flusso e avviare l'acquisizione, senza memorizzare i dati, a circa 5.000-10.000 eventi/s. Una volta che le cellule si sono stabilizzate (15-30 s), avviare l'acquisizione dei dati e raccogliere i dati per almeno 10 s per stabilire lo sfondo.
- Al segno di moccio 10, rimuovere rapidamente la provetta dal citometro a flusso, aggiungere la stimolazione (5-50 μM di liposomi antigenici in 2-20 μL), pulsare il vortice e riportare la provetta FACS sul citometro a flusso. Mantieni l'acquisizione e l'archiviazione dei dati durante questo periodo di tempo e raccogli i dati per 3-5 minuti.
- Analizza i dati in un software di analisi appropriato con le funzioni cinetiche.
Tabella 1: Calcoli per la creazione di un liposoma con concentrazione lipidica totale di 1,25 μM.Esempio di tabella di calcolo per liposomi di frammenti di IgM F(ab) anti-topo di capra.
| Mw | 790 | 387 | 2900 | 3000 | 48000 | |
| DSPC | colesterolo | PEG-DSPE | eccesso PEG-DSPE | aIgM-PEG-DSPE | totale |
| Rapporto molare | 57 | 38 | 3.9 | 1 | 0,1 | 100,00 |
| Massa (mg) | 0,56 | 0,18 | 0,14 | 0,04 | 0,06 | 0,98 |
| mmol | 0,71 | 0,47 | 0,05 | 0,01 | 0,00 | 1.25 |
| Ml | 112,50 | 45,93 | 70,64 | 0,00 | 525,97 | 755,03 |
| | | Conc. (mg/mL) | | | |
| | DSPC | 5 | | | |
| | colesterolo | 4 | | | |
| | PEG-DSPE | numero arabo | | | |
| | aIgM-PEG-DSPE | 0,114 | | | |
