Concentrazione di proteine filtrate per colture batteriche utilizzando un dispositivo di ultrafiltrazione

Abstract

Fonte: Ryan, J. M., et al. Mycobacterium tuberculosis Arricchimento delle vescicole extracellulari attraverso la cromatografia ad esclusione dimensionale. J. Vis. Exp. (183) (2022)

Questo video dimostra l'isolamento e la concentrazione delle proteine filtrate della coltura batterica, che includono vescicole extracellulari batteriche, utilizzando l'ultrafiltrazione. Le vescicole extracellulari concentrate fungono da marcatori diagnostici per il rilevamento della malattia.

Protocollo

1. Preparazione di concentrato grezzo di vescicole extracellulari (EV) di Mycobacterium tuberculosis (Mtb)

NOTA: Per le procedure dettagliate sulla coltivazione di Mtb e la preparazione della coltura di proteine filtrate (CFP). Si raccomanda che i terreni di coltura batterica siano privi di integratori per la crescita con componenti contenenti EV o proteici, come l'albumina oleica destrosio catalasi (OADC) e detergenti come Tween. Si raccomanda inoltre di sottoporre a screening la qualità della coltura batterica e la CFP raccolta per garantire una morte cellulare e una lisi limitate.

1. Preparare un filtro centrifugo con taglio del peso molecolare (MWCO) da 100 kDa (vedere la tabella dei materiali) aggiungendo l'intera capacità di volume di soluzione salina tamponata con fosfato (1x PBS). Centrifugare per 5 minuti a 2.800 x g a 4 °C.
   NOTA: Sesi utilizza un filtro senza volume di arresto a vuoto, è necessario prestare attenzione per garantire che il volume del campione non si riduca al di sotto del livello del filtro, con conseguente asciugatura completa del filtro durante la centrifugazione.
2. Eliminare il flusso continuo e l'eventuale PBS rimanente prima di riempire la camera del campione con Mtb CFP alla sua capacità massima. Centrifugare a 2.800 x g a 4 °C fino a quando il volume non si è ridotto al volume minimo del dispositivo di ultrafiltrazione. Ripetere se necessario, aggiungendo più CFP all'unità fino a quando l'intero campione non è stato ridotto a sufficienza.
   nota: Se lo si desidera, è possibile conservare una parte del materiale a flusso continuo (100F) da 100 kDa per la qualifica a valle. Conservare a 4 °C.
3. Aggiungere 1x PBS all'unità filtro contenente il concentrato fino alla capacità totale del dispositivo. Ridurre il volume come descritto al punto 1.2. Ripetere questo passaggio cinque volte per garantire il lavaggio completo e la sostituzione del tampone.
4. Recuperare il retentato di CFP concentrato da 100 kDa (100R) secondo le specifiche del dispositivo di ultrafiltrazione (vedere la tabella dei materiali). Una volta recuperato il 100R, lavare il filtro con un volume minimo di 1x PBS almeno tre volte e raggruppare il lavaggio con il 100R per massimizzare il recupero.
5. Quantificare il materiale 100R con un saggio bicinchoninico (BCA) seguendo le istruzioni del produttore (vedere la Tabella dei materiali). Per eseguire il saggio, utilizzare diverse diluizioni di campioni 1:2, 1:5 e 1:10 in PBS. Testare il campione in triplice copia.
   nota: Se lo si desidera, conservare una parte del materiale 100R per la qualifica a valle. Conservare a 4 °C.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Raccoglitore automatico di frazioni	IZON Scienza	AFC-V1-USD
Centricon Plus - 70 Filtro centrifugo, taglio 100 kDa	Millipore Sigma	UFC710008	Dispositivo di ultrafiltrazione utilizzato nel passaggio 1.1
Soluzione salina tamponata con fosfati, 1X senza calcio e magnesio	Corning	21-040-CV
Membrana in nitrocellulosa, rotolo, 0,2 μm	BioRad	1620112