1. Preparazione del concentrato Mtb EV grezzo
NOTA: Per le procedure dettagliate sulla coltivazione di Mtb e la preparazione della proteina filtrata di coltura (CFP), vedi Riferimenti. Si raccomanda che i terreni di coltura batterica siano privi di integratori per la crescita con componenti contenenti EV o proteici, come l'albumina oleica destrosio catalasi (OADC) e detergenti come Tween. Si raccomanda inoltre di sottoporre a screening la qualità della coltura batterica e la CFP raccolta per garantire una morte cellulare e una lisi limitate.
- Preparare un filtro centrifugo con taglio del peso molecolare (MWCO) da 100 kDa (vedere la tabella dei materiali) aggiungendo l'intera capacità di volume di soluzione salina tamponata con fosfato (1x PBS). Centrifugare per 5 minuti a 2.800 x g a 4 °C.
nota: Se si utilizza un filtro senza volume di arresto morto, è necessario prestare attenzione per garantire che il volume del campione non si riduca al di sotto del livello del filtro, con conseguente completa asciugatura del filtro durante la centrifugazione.
- Eliminare il flusso continuo e l'eventuale PBS rimanente prima di riempire la camera del campione con Mtb CFP alla sua capacità massima. Centrifugare a 2.800 x g a 4 °C fino a quando il volume non si è ridotto al volume minimo del dispositivo di ultrafiltrazione. Ripetere se necessario, aggiungendo più CFP all'unità fino a quando l'intero campione non è stato ridotto a sufficienza.
nota: Se lo si desidera, è possibile conservare una parte del materiale a flusso continuo (100F) da 100 kDa per la qualifica a valle. Conservare a 4 °C.
- Aggiungere 1x PBS all'unità filtro contenente il concentrato fino alla capacità totale del dispositivo. Ridurre il volume come descritto al punto 1.2. Ripetere questo passaggio cinque volte per garantire il lavaggio completo e la sostituzione del tampone.
- Recuperare il retentato di CFP concentrato da 100 kDa (100R) secondo le specifiche del dispositivo di ultrafiltrazione (vedere la tabella dei materiali). Una volta recuperato il 100R, lavare il filtro con un volume minimo di 1x PBS almeno tre volte e raggruppare il lavaggio con il 100R per massimizzare il recupero.
- Quantificare il materiale 100R con un saggio bicinchoninico (BCA) seguendo le istruzioni del produttore (vedere la Tabella dei materiali). Per eseguire il saggio, utilizzare diverse diluizioni di campioni 1:2, 1:5 e 1:10 in PBS. Testare il campione in triplice copia.
nota: Se lo si desidera, conservare una parte del materiale 100R per la qualifica a valle. Conservare a 4 °C.
2. Cromatografia ad esclusione dimensionale per l'arricchimento di EV Mtb da CFP
NOTA: La seguente procedura è specifica per l'utilizzo di 3 mg di 100R Mtb CFP con colonna SEC e raccoglitore automatico di frazioni (AFC, vedi Tabella dei materiali). Può essere adattato ad altre concentrazioni iniziali e tipi di colonna seguendo le specifiche del produttore. Inoltre, si consiglia agli utenti di leggere e comprendere il manuale utente del raccoglitore automatico di frazioni.
- Lasciare che la colonna SEC si equilibri a temperatura ambiente.
- Accendere l'AFC utilizzando l'interruttore di alimentazione sul retro dell'unità a torre e regolare le impostazioni per la cella di carico, se necessario, premendo SETUP sul touchscreen del menu principale. La cella di carico deve essere calibrata solo al primo utilizzo, dopo ogni aggiornamento del software e se si nota un'incoerenza nei volumi di raccolta delle frazioni.
- Dalla schermata SETUP, allinea il carosello selezionando CAROSELLO > CALIBRA. Inserire la giostra con i 13 piccoli fori rivolti verso l'alto nella torre AFC e regolare la giostra in modo che l'ugello del fluido si trovi direttamente sopra la posizione di lavaggio premendo i pulsanti - e/o +.
- Rimuovere i tappi dalla colonna SEC bilanciata. Far scorrere la colonna SEC nell'apposito supporto per colonna e installarla con cura sulla torre AFC. Assicurarsi che l'etichetta di identificazione a radiofrequenza (RFID) sulla colonna sia rivolta verso l'AFC e verificare che il collegamento tra la colonna e la valvola sia sicuro. Posizionare il tubo di scarico in un contenitore di raccolta.
- Dalla schermata SETUP, selezionare Programma di raccolta e impostare il conteggio su 13 e la dimensione su 0,5 ml premendo i pulsanti - e/o +. Lasciare l'impostazione "Volume buffer" come impostazione predefinita di 2,7 ml, quindi chiudere la finestra "Programma raccolta" premendo X.
- Selezionare AVVIA RACCOLTA dalla schermata iniziale e confermare i parametri di raccolta selezionando SÌ. Caricare 13 provette per microcentrifuga da 1,7 mL etichettate con i coperchi aperti e rivolti verso il centro del carosello.
- Far avanzare l'AFC selezionando OK, quindi montare il serbatoio della colonna e avanzare nuovamente premendo OK. Selezionare l'opzione per svuotare la colonna premendo SÌ e aggiungere un volume di colonna di 0,2 μm di PBS filtrato per rimuovere qualsiasi buffer di archiviazione. Una volta completato il lavaggio, far avanzare l'AFC premendo OK.
- Posizionare il coperchio del carosello sull'AFC e premere OK. Preparare un volume di colonna di 0,2 μm di PBS filtrato. Utilizzare una pipetta per rimuovere il tampone in eccesso dalla colonna.
- Portare 3 mg di campione 100R come quantificato al passaggio 1,5 a 500 μl con 1x PBS. Aggiungere il campione da 3 mg all'inizio della colonna. Far avanzare l'AFC e lasciare che il campione penetri nella fritta. Una volta che il campione è entrato completamente nella colonna, aggiungere il PBS preparato al punto 2.6 al serbatoio.
- Monitorare l'andamento dell'AFC mentre raccoglie prima il volume degli spazi vuoti e poi le frazioni specificate. Al termine della corsa e dopo che la giostra è tornata in posizione di scarto, rimuovere il coperchio e rimuovere i tubi di frazione dalla giostra. Conservare le frazioni a 4 °C prima della quantificazione (fase 3) e della qualificazione (fase 4).
- Se la colonna deve essere riutilizzata, selezionare l'opzione per pulire la colonna premendo SÌ; in caso contrario, premere NO. Seguire le istruzioni riportate nella cartella AFC.
NOTA: Una volta che la colonna è stata lavata e il buffer di stoccaggio è stato esaurito, può essere rimosso, tappato e conservato a 4 °C.