Una tecnica zWEDGI per visualizzare le larve di pesce zebra infettate da agenti patogeni fungini

Abstract

Fonte: Thrikawala, S. et al., Infezione di larve di pesce zebra con spore di Aspergillus per l'analisi delle interazioni ospite-patogeno.J. Vis. Exp.(2020)

Il video mostra una tecnica di ferimento e intrappolamento del pesce zebra per osservare l'infezione da patogeni fungini marcati in modo fluorescente nelle larve di pesce zebra. L'infezione iniziale attira i macrofagi e, man mano che l'infezione persiste, il reclutamento dei neutrofili progredisce nel sito di iniezione.

Protocollo

1. Preparazione delle spore di Aspergillus per l'iniezione

1. Da una sospensione di spore di Aspergillus, calcolare il volume necessario per ottenere 1 x 10⁶ spore. Il volume dovrebbe essere di 20-100 μl; in caso contrario, produrre una diluizione 10x in Tween-20 sterile allo 0,01% (v/v) (Tween-water; Tabella dei materiali). Ad esempio, se il volume calcolato è 5 μl, produrre una diluizione 10x e utilizzare 50 μl della soluzione diluita.
   nota: Due piastre/ceppi possono essere preparati per raccogliere più spore o come riserva in caso di contaminazione.
2. Distribuire 1 x 10⁶ spore di Aspergillus su una piastra di terreno minimo di glucosio (GMM) (Tabella dei materiali) con uno spandiconcime sterile monouso a forma di L in una cappa di biosicurezza. Evitare di allargare fino al margine della piastra. Incubare a 37 °C per 3-4 giorni, con la piastra rivolta verso il basso.
3. Il giorno del prelievo, portare nell'armadio di biosicurezza un miracloth sterile e provette coniche da 50 ml (due per ceppo), flaconi freschi di acqua Tween-water sterile (uno per ceppo) e spandiconcime sterile monouso a forma di L.
   nota: Miracloth può essere tagliato in ~8 pollici x 6 in pezzi, avvolto in un foglio e sterilizzato in autoclave.
4. Inserire un pezzo di miracloth in ciascuna provetta conica da 50 ml etichettata e richiudere. Estrarre il pacchetto di miracloth rimanente dal cofano.
5. Portare le piastre nella cabina di biosicurezza. Aprire un piatto, quindi versare l'acqua di interpolazione sulla parte superiore fino a coprire circa tre quarti del piatto.
6. Usando uno spandiconcime usa e getta a forma di L, raschiare delicatamente la superficie della coltura fungina con un movimento avanti e indietro, mentre si usa l'altra mano per ruotare la piastra. Raschiare fino a quando quasi tutte le spore sono omogeneizzate nell'acqua Tween.
   nota: A causa dell'elevata idrofobicità, le spore possono creare "sbuffi" quando viene aggiunta acqua di interpolazione o durante la raschiatura. È necessario prestare molta attenzione per evitare la contaminazione di tubi o piastre vicine. Si consiglia di cambiare i guanti e pulire la superficie con etanolo al 70% tra l'estrazione di diversi ceppi.
7. Prendi una provetta conica da 50 ml e rimuovi il pezzo di miracloth. Piegarlo a metà e trasformarlo in un filtro inserito nella parte superiore della provetta conica da 50 mL.
8. Versare l'omogeneizzato fungino dalla piastra sopra il miracloth nel tubo.
   nota: Se vengono preparate due piastre di un ceppo, raschiare entrambe le piastre e versarle nello stesso tubo conico.
9. Versare l'acqua Tween per portare il volume totale nella provetta conica a 50 ml.
10. Centrifugare a 900 x g per 10 minuti. Assicurarsi di utilizzare tappi antiaerosolizzazione nella centrifuga.
11. Versare il surnatante in una soluzione di candeggina al ~10% per decontaminare. Versare 50 mL di soluzione fisiologica sterile tamponata con fosfato (PBS) nella provetta conica, quindi agitare o agitare per risospendere il pellet.
12. Centrifugare nuovamente a 900 x g per 10 min. Versare il surnatante e risospendere il pellet in 5 mL di 1x PBS sterile. Filtrare con un nuovo pezzo di miracloth in una provetta conica fresca da 50 mL.
13. Effettuare diluizioni seriali 10 volte (10x, 100x, 1000x) dell'omogenato fungino in provette da centrifuga da 1,7 mL (ad esempio, per la soluzione 10x, mescolare 100 μL dell'omogenato fungino con 900 μL di Tween-water).
14. Scegliere la prima diluizione in cui le spore non sono visibili quando vengono scaricate in acqua di interpolazione e utilizzare questa diluizione per contare il numero di spore utilizzando un emocitometro.
15. Calcolare la concentrazione di spore nell'omogenato fungino preparato (sospensione acquosa) utilizzando la seguente formula:
    Concentrazione (spore/mL) = Numero di spore nelle 25 scatole centrali x fattore di diluizione x 10⁴
16. Preparare una riserva da 1 mL di 1,5 x 10⁸ spore/mL in 1x PBS sterile in una provetta da microcentrifuga da 1,7 mL. Questo preparato di spore può essere conservato a 4 °C per ~4 settimane.
17. Prima dell'uso nelle iniezioni, mescolare 20 μl del preparato di spore con 10 μl di rosso fenolo sterile all'1% in una provetta da centrifuga da 1,7 mL per ottenere una concentrazione finale di spore di 1 x 10⁸ spore/mL. Agitare accuratamente prima dell'iniezione.
    NOTA: La soluzione di rosso fenolo all'1% deve essere sterilizzata con filtro e conservata in aliquote.
18. Per un'iniezione simulata, miscelare 20 μl di 1x PBS con 10 μl di rosso fenolo sterile all'1%.

2. Preparazione delle piastre di agar per l'iniezione

1. Preparare l'agarosio al 2% in terreno E3 e sciogliere in microonde.
2. Versare in una piastra Petri da 100 mm x 15 mm (~25 ml per piastra), agitare per coprire uniformemente la piastra e lasciare raffreddare.
3. Avvolgere la piastra con pellicola di paraffina e conservare capovolta a 4 °C.
4. Prima dell'iniezione, portare la piastra a temperatura ambiente (RT).
5. Versare ~1 mL di albumina sierica bovina (BSA) al 2% sterilizzata con filtro sulla piastra, inclinare la piastra per stendere e coprire l'intero fondo e risciacquare con E3.
   NOTA: La soluzione di BSA al 2% può essere sterilizzata con filtro e conservata in aliquote da 1 mL a -20 °C. Il pretrattamento BSA al 2% impedisce alle larve di attaccarsi alla superficie dell'agarosio.
6. Versare E3 con tricaina tamponata sulla piastra e lasciarla riposare fino all'iniezione.

3. Microiniezione del ventricolo posterioreencefalico della larva di pesce zebra

1. Larve di decorionato manualmente con pinza a 2 dpf in una capsula di Petri.
   nota: La decorionazione può essere eseguita in qualsiasi momento da 1,5 dpf fino al momento dell'iniezione.
2. Rimuovere la quantità di E3 possibile dalla capsula di Petri e aggiungere 300 μg/mL di tricaina tamponata in E3 per anestetizzare le larve.
   nota: Una soluzione madre di tricaina tamponata 4 mg/mL in E3 può essere preparata e conservata a 4 °C. La soluzione di lavoro può essere ottenuta diluendo 4 mL della soluzione madre fino a 50 mL con E3.
3. Utilizzare una configurazione di microiniezione fornita con l'iniettore di pressione, l'unità di contropressione, l'interruttore a pedale, il supporto per micropipette, il micromanipolatore e un supporto magnetico e una piastra, tutti collegati a una fonte di aria compressa (Tabella dei materiali).
4. Aprire la valvola dell'aria compressa e accendere il microiniettore. Impostare la pressione su ~25 PSI, la durata dell'impulso su 60 ms e l'unità di contropressione su 1 libbra per pollice quadrato (PSI).
5. Caricare un ago per microiniezione utilizzando un puntale per pipetta microloader (Tabella dei materiali) con circa 3-5 μl di PBS preparato o sospensione di spore con rosso fenolo. Montare l'ago sul micromanipolatore.
   nota: Gli aghi per microiniezione possono essere preparati come descritto in precedenza. Lo stereomicroscopio utilizzato per le microiniezioni deve essere dotato di un reticolo oculare per calibrare l'ago per microiniezione. Il reticolo deve essere calibrato con un micrometro da tavolino e deve essere determinata la lunghezza della scala del reticolo (μm). Il diametro della goccia di sospensione di spore che viene espulsa dall'ago viene misurato in base al numero di hash (del reticolo) che si sovrappongono alla goccia.
6. Posizionare il micromanipolatore in modo che l'estremità dell'ago sia visibile all'ingrandimento più basso sotto lo stereomicroscopio. Zoom fino a 4x, mantenendo l'ago in vista.
7. Usando una pinza affilata, agganciare l'estremità dell'ago. Premere il pedale di iniezione per visualizzare la dimensione della gocciolina che fuoriesce. Continua a riagganciare fino a quando non vengono iniettati ~3 nL di sospensione di spore (qui, si tratta di cinque hash).
8. Spostare il micromanipolatore e l'ago in modo che non siano d'intralcio per evitare di colpire accidentalmente l'ago mentre le larve sono disposte sulla piastra di iniezione.
9. Versare l'E3-tricaina dalla piastra di iniezione, quindi trasferire ~24 larve anestetizzate sulla piastra di iniezione con la minor quantità possibile di E3 utilizzando una pipetta di trasferimento.
10. Utilizzando un piccolo strumento per manipolare le larve di pesce zebra (ad esempio, uno strumento per anelli per capelli o uno strumento per ciglia), disporre le larve in base alla direzione in cui sono rivolte. In particolare, posiziona tutti rivolti a destra in una riga e tutti rivolti a sinistra in una riga sottostante.
    nota: Questa disposizione è difficile se c'è troppo liquido sul piatto, poiché le larve "galleggeranno" fuori posto. Tuttavia, una quantità insufficiente di liquido è problematica anche se le iniezioni richiedono molto tempo, poiché le larve possono seccarsi o l'anestesia svanire. Pertanto, è necessario prestare particolare attenzione alla quantità di liquido sulla piastra durante l'intero processo di microiniezione.
11. Regolare lo zoom del microscopio sull'ingrandimento più basso. Riportare indietro il micromanipolatore e sistemarlo in modo che l'ago sia vicino alle larve, con un angolo di ~30°-60°, al centro del campo visivo.
12. Ingrandisci fino all'ingrandimento massimo e utilizza le manopole di regolazione fine per regolare ulteriormente la posizione dell'ago. Verificare che ~30-70 spore escano dall'ago iniettando la sospensione di spore nel liquido sulla piastra accanto alle larve. Regolare il tempo e la pressione sulla configurazione dell'iniezione, se necessario.
    nota: Questo test deve essere ripetuto ogni cinque o sei larve, poiché il numero di spore che escono dall'ago può aumentare o diminuire nel tempo.
13. Partendo dalla fila in cui le larve sono rivolte verso l'ago, sposta la piastra in modo che l'ago sia direttamente sopra e posizionato vicino alle prime larve.
14. Spostando l'ago con il micromanipolatore, inserire l'ago attraverso il tessuto attorno alla vescicola otica per perforare il ventricolo rombencefalico. Muovere la piastra con l'altra mano secondo necessità per ottenere il giusto orientamento della larva con l'angolo dell'ago.
15. Verificare visivamente che l'estremità dell'ago si trovi al centro del ventricolo rombencefalico, premere il pedale per iniettare le spore e ritrarre delicatamente l'ago.
    nota: Il colorante rosso fenolo dovrebbe rimanere principalmente all'interno del ventricolo rombencefalico. Una piccola quantità può entrare nel mesencefalo, ma non dovrebbe raggiungere il proencefalo o al di fuori del cervello. In tal caso, il volume iniettato è troppo grande e la pressione e il tempo devono essere ridotti di conseguenza, oppure deve essere calibrato un nuovo ago.
16. Scendendo lungo la piastra, iniettare tutte le larve in quella fila. Quindi, girare la piastra e iniettare tutte le larve nell'altra fila.
    nota: Le larve iniettate senza successo o danneggiate accidentalmente possono essere contrassegnate da 1) iniettare nel tuorlo un paio di volte per creare un segno rosso o 2) trascinare la larva fuori dalla fila con l'ago.
17. Muovi l'ago verso l'alto e allontanalo di nuovo. Ridurre lo zoom a un ingrandimento inferiore sul microscopio. Il colorante rosso fenolo dovrebbe essere ancora visibile nel rombencefalo di ogni larva.
18. Per prima cosa, tirare via con uno strumento ad anello per capelli e pipettare per smaltire eventuali larve con iniezioni non riuscite. Trasferire le larve rimanenti in una nuova capsula di Petri lavandole via dalla piastra con E3 sterile fresco e una pipetta di trasferimento.
19. Ripetere se necessario per il numero di campione sperimentale finale desiderato.
20. Sciacquare le larve almeno 2 volte con E3 e garantire il recupero dall'anestesia.
21. Per quantificare la sopravvivenza senza ulteriori trattamenti, utilizzando una pipetta di trasferimento, trasferire le larve in una piastra a 96 pozzetti (1 larva per pozzetto) in E3.

4. Definizione del numero di spore iniettate e vitali

1. Immediatamente dopo l'iniezione, utilizzando una pipetta di trasferimento, prelevare a caso circa otto delle larve iniettate e trasferirle in provette da centrifuga da 1,7 ml (una larva per provetta).
2. Sopprimere le larve con la tricaina o posizionarle a 4 °C per 0,5-2,0 ore.
3. Preparare 1 mL di 1 mg/mL di ampicillina e 0,5 mg/mL di soluzioni antibiotiche di kanamicina in 1x PBS sterile. La soluzione rimanente può essere conservata a 4 °C e utilizzata in seguito.
   nota: Le soluzioni madre di ampicillina a 100 mg/mL e kanamicina a 50 mg/mL possono essere preconfezionate, sterilizzate con filtro e conservate in aliquote a -20 °C. Diluirle 100x in 1x PBS per ottenere la soluzione di lavoro.
4. Utilizzando una pipetta, rimuovere quanto più liquido possibile dalla provetta da centrifuga, lasciando indietro la larva, e aggiungere 90 μl di 1x PBS con antibiotici.
   nota: Gli antibiotici vengono utilizzati per prevenire la crescita batterica nelle piastre GMM che può interferire con il conteggio delle colonie di Aspergillus.
5. Omogeneizzare le larve in un lisatore tissutale a 1.800 oscillazioni/min (30 Hz) per 6 min. Centrifugare a 17.000 x g per 30 s.
6. Etichettare le piastre GMM (una piastra per larve omogeneizzate). Utilizzando un bruciatore Bunsen per creare un ambiente sterile, pipettare la sospensione omogeneizzata da un tubo al centro della piastra GMM, quindi stendere utilizzando uno spandiconcime monouso a forma di L. Evitare di stendere l'omogeneizzato contro il bordo.
7. Incubare le piastre capovolte a 37 °C per 2-3 giorni e contare il numero di colonie formate, unità formante colonia (CFU).
8. Per misurare il numero di spore vive durante il periodo dell'infezione, prelevare le larve dalle piastre a 96 pozzetti a 1-7 giorni dopo l'iniezione (dpi) e trasferirle in provette da centrifuga. Eutanasia e omogeneizzazione delle larve per diffonderle su piastre GMM come descritto nei passaggi 4.1-4.5.

5. Trattamento farmacologico delle larve iniettate

1. Dopo il paragrafo 4, dividere le restanti larve iniettate in due piastre da 3,5 mm: una per il trattamento farmacologico e una per il controllo. Utilizzare circa 24 larve infette per condizione.
   nota: Le piastre da 3,5 mm possono essere trattate con il 2% di latte scremato in polvere, in acqua, sciacquate, asciugate all'aria e conservate in RT. Il rivestimento con latte impedirà alle larve di attaccarsi alla plastica.
2. Preparare la soluzione farmacologica desiderata e il veicolo in E3 senza blu di metilene in tubi conici in base alla concentrazione finale richiesta, quindi mescolare bene. Ad esempio, per monitorare la sopravvivenza delle larve esposte al desametasone, utilizzare 24 larve (repliche) per il desametasone e 24 per il controllo del veicolo, come il dimetilsolfossido (DMSO). Preparare 5 ml di soluzione farmacologica alla concentrazione richiesta. Qui, sono stati utilizzati 5 mL di DMSO allo 0,1% e 10 μM di desametasone, e 24 larve/condizione sono state trasferite a ~200 μL del veicolo/soluzione farmacologica/larve.
3. Rimuovere quanto più liquido possibile da una piastra con una pipetta di trasferimento e aggiungere E3 premiscelato contenente il controllo del veicolo. Ripetere con l'E3 premiscelato contenente il trattamento di interesse per l'altro piatto.
4. Utilizzando una pipetta, trasferire le larve in una piastra a 96 pozzetti (una larva per pozzetto). Monitorare la sopravvivenza delle larve iniettate esposte al veicolo o al farmaco per 7 giorni.
   nota: Il farmaco può essere applicato esclusivamente il giorno dell'infezione e tenuto sulle larve per l'intero esperimento o può essere rinfrescato quotidianamente.

6. Imaging quotidiano di larve infette utilizzando il dispositivo per ferimento e intrappolamento del pesce zebra per la crescita e l'imaging (zWEDGI)

1. Assicurarsi che le larve siano trattate con 100 μM di N-feniltiourea (PTU) a 24 hpf per prevenire la pigmentazione e che il PTU sia mantenuto sulle larve per l'intero esperimento.
   nota: La PTU a 75-100 μM previene la pigmentazione delle larve senza difetti di sviluppo macroscopici. Tuttavia, il PTU può interferire con alcuni processi biologici e i ricercatori dovrebbero determinare in anticipo se il farmaco può influenzare i processi oggetto di indagine.
2. Infettare larve transgeniche con popolazioni cellulari marcate di interesse a 2 dpf con spore di Aspergillus ingegnerizzate per esprimere una proteina fluorescente, come descritto nella sezione 3. Quindi, trasferire le larve infette nei pozzetti di una piastra a 48 pozzetti in circa 500 μL/pozzetto di E3 senza blu di metilene.
   nota: Qui viene utilizzata una piastra a 48 pozzetti perché è più facile trasferire le larve dentro e fuori durante l'imaging giornaliero ripetuto.
3. Il giorno dell'imaging, preparare due piastre di Petri da 3,5 mm: una con PTU da 100 μM e una con E3-tricaina.
4. Aggiungere E3-tricaina nelle camere di un dispositivo zWEDGI. Sotto lo stereomicroscopio, rimuovere le bolle d'aria dalle camere e dal canale di contenimento utilizzando una micropipetta P100. Rimuovere tutta la E3-tricaina in eccesso, in modo che sia solo nelle camere.
5. Pipettare una larva dalla piastra utilizzando una pipetta di trasferimento. Se si utilizza molto liquido per rimuoverlo, pipettarlo in un piatto da 3,5 mm contenente E3-PTU. Quindi, pipettare di nuovo, utilizzando meno liquido possibile, e trasferire in E3-tricaina.
6. Attendere ~30 s per l'anestesia, quindi trasferire nella camera di carico del dispositivo di ferita e intrappolamento (ad es. zWEDGI).
7. Sotto lo stereomicroscopio, posizionare la larva. Utilizzare la micropipetta P100 per rimuovere la E3-tricaina dalla camera di ferita e rilasciarla nella camera di carico per spostare la coda della larva nel canale di restrizione. Assicurarsi che la larva sia posizionata sul lato laterale, dorsale o dorsolaterale in modo che il rombencefalo possa essere visualizzato con una lente dell'obiettivo invertita.
8. Immagine della larva con un microscopio confocale.
9. Dopo l'imaging, con la pipetta P100, rilasciare E3-tricaina nella camera di ferita per spingere la larva dal canale di contenimento nella camera di carico.
10. Utilizzando una pipetta di trasferimento, prelevare la larva e trasferirla nuovamente nella capsula di Petri con E3-Tricaina. Utilizzando meno liquido possibile, trasferirlo nella piastra di Petri con E3-PTU. Sciacquare in PTU e trasferire nuovamente nella piastra a 48 pozzetti.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Pinza di Dumont #5	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5045
Reticolo oculare	Mondo Microscopio	RETR10	Per la calibrazione degli aghi, utilizzato nello stereomicroscopio
Configurazione del microiniettore: Unità di contropressione	Strumentazione Scientifica Applicata	BPU
Interruttore a pedale	Strumentazione Scientifica Applicata	FTSW
Kit porta micropipette	Strumentazione Scientifica Applicata	M-Pip
Iniettore di pressione	Strumentazione Scientifica Applicata	MPPI-3
Configurazione del micromanipolatore: Micromanipolatore	Narashige (Tritech)	M-152
Supporto magnetico e piastra	Tritech	MINJ-HBMB
Estrattore dell'ago	Strumento Sutter	P-97
Stereomicroscopio	Nikon	SMZ-745
Tissuelyser II	Qiagen	Codice 85300	Per omogeneizzare le larve
materiale
agarosio	pescatore	BP160-500
Sale sodico di ampicillina	pescatore	AAJ6380706
BSA, frazione V	VWR	AAJ65855-22
Kanamicina solfato	pescatore	AAJ1792406
Spandiconcime a L	pescatore	Codice: 14 665 230
Aghi microcapillari (senza filamento)	Strumenti di precisione mondiali (WPI)	TW100-3
Puntali per pipette Microloader	VWR	89009-310	Per caricare l'ago con la sospensione di Aspergillus
Panno Mirato	VWR	EM475855-1R	Per filtrare la sospensione di Aspergillus
N-feniltiourea	pescatore	AAL0669009	Per prevenire la pigmentazione
Rosso fenolo, soluzione all'1%	pescatore	Codice: 57254
Tricaina (3-amminobenzoato di etile, sale dell'acido metansolfonico)	pescatore	AC118000500	Per anestetizzare le larve
Interpolazione-20	pescatore	BP337-500
Media e Soluzioni			Componenti/Ricetta
Supporti E3: 60x E3			17,2 g NaCl, 0,76 g KCl, 2,9 g CaCl2, 4,9 g MgSO4 · 7H2O, fino a 1 L con H2O
1x E3			16,7 ml 60x brodo, 430 ul 0,05 M NaOH, a 1 L con H2O (opzionale: + 3 ml 0,01% blu di metilene)
Soluzione madre di tricaina			2 g di tricaina, 5 g di Na2HPO4 · 7H2O, 4,2 ml di 60X E3, fino a 500 ml con H2O, pH fino a 7,0-7,5 con NaOH
Terreno di coltura con glucosio minimo (GMM): agar GMM			10 g di glucosio (destrosio), 50 ml 20x sali di nitrato, 1 ml di TE, fino a 1 L con H2O, pH fino a 6,5 con NaOH, + 16 g di Agar, autoclave
20x Sali di nitrato			120 g NaNO3, 10,4 g KCl, 10,4 g, MgSO4 · 7H2O, 30,4 g, KH2PO4, fino a 1 L con H2O, autoclave
Oligoelementi (TE)			2,20 g di ZnSO4 · 7H2O, 1,10 g di H3BO3, 0,50 g di MnCl2 · 4H2O, 0,16 g di FeSO4 · 7H2O, 0,16 g di CoCl2 · 6H2O, 0,16 g di CuSO4 · 5H2O, 0,11 g (NH4)6Mo7O24 · 4H2O, 5,00 g di Na2EDTA, fino a 100 ml con H2O, sciogliere agitando per una notte, in autoclave