Una tecnica zWEDGI per visualizzare le larve di pesce zebra infettate da agenti patogeni fungini

Abstract

Fonte: Thrikawala, S. et al., Infezione di larve di pesce zebra con spore di Aspergillus per l'analisi delle interazioni ospite-patogeno.J. Vis. Exp.(2020)

Il video mostra una tecnica di ferimento e intrappolamento del pesce zebra per osservare l'infezione da patogeni fungini marcati in modo fluorescente nelle larve di pesce zebra. L'infezione iniziale attira i macrofagi e, man mano che l'infezione persiste, il reclutamento dei neutrofili progredisce nel sito di iniezione.

Protocollo

1. Preparazione delle spore di Aspergillus per l'iniezione

1. Da una sospensione di spore di Aspergillus, calcolare il volume necessario per ottenere 1 x 10⁶ spore. Il volume dovrebbe essere di 20-100 μl; in caso contrario, produrre una diluizione 10x in Tween-20 sterile allo 0,01% (v/v) (Tween-water; Tabella dei materiali). Ad esempio, se il volume calcolato è 5 μl, produrre una diluizione 10x e utilizzare 50 μl della soluzione diluita.
   nota: Due piastre/ceppi possono essere preparati per raccogliere più spore o come riserva in caso di contaminazione.
2. Distribuire....

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Pinza di Dumont #5	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5045
Reticolo oculare	Mondo Microscopio	RETR10	Per la calibrazione degli aghi, utilizzato nello stereomicroscopio
Configurazione del microiniettore: Unità di contropressione	Strumentazione Scientifica Applicata	BPU
Interruttore a pedale	Strumentazione Scientifica Applicata	FTSW
Kit porta micropipette	Strumentazione Scientifica Applicata	M-Pip
Iniettore di pressione	Strumentazione Scientifica Applicata	MPPI-3
Configurazione del micromanipolatore: Micromanipolatore	Narashige (Tritech)	M-152
Supporto magnetico e piastra	Tritech	MINJ-HBMB
Estrattore dell'ago	Strumento Sutter	P-97
Stereomicroscopio	Nikon	SMZ-745
Tissuelyser II	Qiagen	Codice 85300	Per omogeneizzare le larve
materiale
agarosio	pescatore	BP160-500
Sale sodico di ampicillina	pescatore	AAJ6380706
BSA, frazione V	VWR	AAJ65855-22
Kanamicina solfato	pescatore	AAJ1792406
Spandiconcime a L	pescatore	Codice: 14 665 230
Aghi microcapillari (senza filamento)	Strumenti di precisione mondiali (WPI)	TW100-3
Puntali per pipette Microloader	VWR	89009-310	Per caricare l'ago con la sospensione di Aspergillus
Panno Mirato	VWR	EM475855-1R	Per filtrare la sospensione di Aspergillus
N-feniltiourea	pescatore	AAL0669009	Per prevenire la pigmentazione
Rosso fenolo, soluzione all'1%	pescatore	Codice: 57254
Tricaina (3-amminobenzoato di etile, sale dell'acido metansolfonico)	pescatore	AC118000500	Per anestetizzare le larve
Interpolazione-20	pescatore	BP337-500
Media e Soluzioni			Componenti/Ricetta
Supporti E3: 60x E3			17,2 g NaCl, 0,76 g KCl, 2,9 g CaCl2, 4,9 g MgSO4 · 7H2O, fino a 1 L con H2O
1x E3			16,7 ml 60x brodo, 430 ul 0,05 M NaOH, a 1 L con H2O (opzionale: + 3 ml 0,01% blu di metilene)
Soluzione madre di tricaina			2 g di tricaina, 5 g di Na2HPO4 · 7H2O, 4,2 ml di 60X E3, fino a 500 ml con H2O, pH fino a 7,0-7,5 con NaOH
Terreno di coltura con glucosio minimo (GMM): agar GMM			10 g di glucosio (destrosio), 50 ml 20x sali di nitrato, 1 ml di TE, fino a 1 L con H2O, pH fino a 6,5 con NaOH, + 16 g di Agar, autoclave
20x Sali di nitrato			120 g NaNO3, 10,4 g KCl, 10,4 g, MgSO4 · 7H2O, 30,4 g, KH2PO4, fino a 1 L con H2O, autoclave
Oligoelementi (TE)			2,20 g di ZnSO4 · 7H2O, 1,10 g di H3BO3, 0,50 g di MnCl2 · 4H2O, 0,16 g di FeSO4 · 7H2O, 0,16 g di CoCl2 · 6H2O, 0,16 g di CuSO4 · 5H2O, 0,11 g (NH4)6Mo7O24 · 4H2O, 5,00 g di Na2EDTA, fino a 100 ml con H2O, sciogliere agitando per una notte, in autoclave