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La tecnica di fotoconversione per esplorare la dinamica delle cellule infiammatorie nelle pupe di insetti

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

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Fonte: Weavers, H. et al., Monitoraggio in vivo a lungo termine delle dinamiche cellulari infiammatorie all'interno di Drosophila Pupae.J. Vis. Exp. (2018)

Il video dimostra l'uso della fotoconversione per studiare la dinamica delle cellule infiammatorie nelle pupe di Drosophila. Gli emociti verdi sono attratti dall'epitelio ferito, seguiti da una migrazione a distanza. La fotoconversione sposta alcuni emociti dal verde al rosso, facilitando il loro tracciamento del movimento.

Protocol

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Questo protocollo consiste in quattro fasi principali sequenziali: (1) Preparazione degli stock di Drosophila e stadiazione delle pupe di Drosophila, (2) Dissezione e montaggio delle pupe, (3) Ferita delle pupe, (4) imaging confocale time-lapse in vivo.

1. Preparazione delle scorte di Drosophila e stadiazione delle pupe

  1. Procurarsi ceppi appropriati di Drosophila (vedi Introduzione e Tabella dei Materiali).
  2. Raccogli mosche giovani e adulte del genotipo appropriato.
    1. Seleziona i moscerini adulti utilizzando tamponi di gas di anidrid....

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Results

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Figura 1: Preparazione della pupa di Drosophila per la ferita e l'imaging dal vivo. (A) Prepupe bianche di Drosophila raccolte a 0 h APF, con l'estremità anteriore indicata da appendici respiratorie estroflesse (spiracoli). (B) Dopo aver allevato prepupe APF bianche 0h per 18 ore a 25 °C, il pupario appare marrone. La dissezione del caso pupale dovr.......

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Disclosures

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Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Azioni di Drosophila
Onnipresente E-caderina marcata GFP; Ubi-p63E-shg.GFP; (chrII)Centro Azionario di Kyoto, DGRC#109007Le sequenze del promotore Ubi-p63E guidano l'espressione di Drosophila E-caderina (fucile da caccia) marcata all'estremità C-terminale con GFP.
Onnipresente E-caderina con tag GFP; Ubi-p63E-shg.GFP (III)Centro di stoccaggio di Drosophila di Bloomington (Università dell'Indiana)#58742Le sequenze del promotore Ubi-p63E guidano l'espressione di Drosophila E-caderina (fucile da caccia) marcata all'estremità C-terminale con GFP.
Ubiquitario Moesin con tag GFP P{sGMCA}3.1Centro di stoccaggio di Drosophila di Bloomington (Università dell'Indiana)#59023Il promotore/potenziatore sqh espresso in modo ubiquitario guida l'espressione di un frammento di Moesin (che include le sequenze di legame dell'actina) marcato con GFPS65T.
Driver specifico per l'emocita serpente-Gal4 ; srp-Gal4;Generato da Katja BrucknerGenerato da Katja BrucknerL'espressione di Scer\GAL4 fusa con una coda di poliA è controllata da 2 sequenze genomiche provenienti da monte di Drosophila serpent. Rif: Brückner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C.M., Rørth, P., Perrimon, N. Il recettore PDGF/VEGF controlla la sopravvivenza delle cellule del sangue in Drosophila. Cellula di sviluppo. 7 (1), 73–84, doi: 10.1016/j.devcel.2004.06.007 (2004).
UAS-nucleareRFP w1118;; P{UAS-RedStinger}6Centro di stoccaggio di Drosophila di Bloomington (Università dell'Indiana)#8545 o #8547Le sequenze regolatorie UAS guidano l'espressione della forma DsRed.T4 di RFP che è marcata all'estremità C-terminale con un segnale di localizzazione nucleare
UAS-GFP citoplasmatica ;; P{UAS-GFP. S65T}Centro di stoccaggio di Drosophila di Bloomington (Università dell'Indiana)Più stock disponibili (es. #1522)Espressione della versione S65T della GFP da parte di sequenze regolatorie UAS; la variante S65T mostra una maggiore luminosità.
UAS-fotoconvertibileKaede w1118;; P{UAS-Kaede.A}3Centro di stoccaggio di Drosophila di Bloomington (Università dell'Indiana)#26161La proteina Kaede emette una fluorescenza verde brillante dopo la sintesi, ma cambia in modo efficiente in una fluorescenza rossa brillante stabile durante l'irradiazione con i raggi UV.
Spaghetti di zucca con tag GFP w1118;; P{sqh-GFP.RLC}Centro di stoccaggio di Drosophila di Bloomington (Università dell'Indiana)#57145La regione codificante sqh, che è marcata all'estremità C-terminale con un tag T:Avic\GFPS65T, è espressa sotto il controllo del promotore sqh naturale.
Ingredienti per terreni di alimentazione per moscheI terreni di alimentazione per mosche sono realizzati secondo le procedure standard (vedi Greenspan, R. 1997. Spingere le mosche: la teoria e la pratica della genetica della Drosophila. Cold Spring Harbor Press. 1-191 pp.)
maisWild Oats, Bristol, Regno Unito (o fornitore equivalente)Contatta il fornitore direttamenteorganico
Farina di soiaWild Oats, Bristol, Regno Unito (o fornitore equivalente)Contatta il fornitore direttamenteorganico
Estratto di maltoWild Oats, Bristol, Regno Unito (o fornitore equivalente)Contatta il fornitore direttamenteorganico
melassaWild Oats, Bristol, Regno Unito (o fornitore equivalente)Contatta il fornitore direttamenteorganico
Difco agarBD Bioscienze, Fisher ScientificDF0142-15-2Per la preparazione di cibo per mosche
Acido propionicosigma402907Per la preparazione di cibo per mosche
NipagensigmaCodice 79721Per la preparazione di cibo per mosche
Lievito di birra essiccatoRedstar, Dutscher Scientific, UK LTDRedstar, Dutscher Scientific, UK LTDPer la preparazione di cibo per mosche
Preparazione e montaggio del campione
ParafilmsigmaP7793-1EAPer la preparazione della colla eptanica
Pennello di zibellino fineDaler-Rowney (o equivalente)#0 o 1
forcipeFisher Scientific (o strumenti di scienze fini)NC9404145Dumont #5
Dischi con fondo in vetro per l'imagingMatTekP35G-0-10-CSi consiglia di utilizzare piastre di Petri da 35 mm, con almeno un Microwell da 10 mm, vetro di copertura da 0,085-0,13 mm, non rivestito. Le piastre con micropozzetti più grandi consentiranno di montare e visualizzare un numero crescente di pupe in un singolo esperimento.
eptanosigma51730-5MLPer la preparazione della colla eptanica
Nastro biadesivo (es. Scotch)Agar ScientificoAGG263Per la preparazione della colla eptanica
Tubo da 50 ml (per colla eptanica)Tubi Falcon di Fisher Scientific14-432-22Per la preparazione della colla eptanica
Vetrini per microscopio in vetroAgar ScientificoAGL4244Per la dissezione di pupe di Drosophila
Stereomicroscopio da dissezione con campo chiaroLeica (o equivalente)M50Per la dissezione di pupe di Drosophila
MicroforbiciJohn Weiss International103123Forbici da ricerca in miniatura (dritte)
Ablazione laser e imaging
Laser per ablazione con nitogenoSpectra-Physics (o Andor equivalente)Modello VSL-337ND-SPer le ferite, questo dovrebbe essere collegato a un sistema di imaging a campo largo
Microscopio confocale a scansione laser multilaser (CLSM)Leica (o equivalente)TCS AOBS SP8 o SP5-II collegato a un microscopio a epifluorescenza invertita Leica DMi8 (o equivalente)Idealmente include uno stadio motorizzato per la scansione multi-sito e "a mosaico", oltre a rivelatori GaAsP "ibridi" (che offrono una sensibilità molto maggiore e l'aumento del segnale basso)
Camera climaticaServizi di imaging Life (o equivalente)"Sistema di controllo della temperatura del microscopio"Collegato al microscopio confocale per il controllo della temperatura durante l'imaging
Software di analisi delle immagini
Modulo software FRAPLeica (o equivalente)Modulo software CLSM FRAPPer l'esecuzione di fotoconversione di fluorofori fotoconvertibili come Kaede
ImageJ (software di analisi delle immagini)Istituti Nazionali di Sanità (NIH)https://imagej.nih.gov/ij/Schneider, C.A., Rasband, W.S., Eliceiri, K.W. "NIH Image to ImageJ: 25 anni di analisi delle immagini". Metodi della natura 9, 671-675, 2012.
Plugin ImageJ "Tracciamento manuale"Istituti Nazionali di Sanità (NIH)https://imagej.net/Manual_Tracking
Plug-in ImageJ "TrackMate"ImageJ, NIHhttps://imagej.net/TrackMateTinevez, JY.; Perry, N. & Schindelin, J. et al. (2016), "TrackMate: una piattaforma aperta ed estensibile per il tracciamento di singole particelle.", Metodi 115: 80-90, PMID 27713081
Volocity (software di imaging 3D ad alte prestazioni)Perkin ElmerVolocity 6,3Per l'analisi delle immagini
IMARIS (software di analisi delle immagini)Piano bitIMARIS per Biologi CellulariPer l'analisi delle immagini

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Photoconversion TechniqueInflammatory Cell DynamicsDrosophila PupaeConfocal MicroscopyTime lapse ImagingHemocyte MigrationWound HealingFluorescent Labeling405 nanometer LaserCell Tracking

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