La tecnica di fotoconversione per esplorare la dinamica delle cellule infiammatorie nelle pupe di insetti

Abstract

Fonte: Weavers, H. et al., Monitoraggio in vivo a lungo termine delle dinamiche cellulari infiammatorie all'interno di Drosophila Pupae.J. Vis. Exp. (2018)

Il video dimostra l'uso della fotoconversione per studiare la dinamica delle cellule infiammatorie nelle pupe di Drosophila. Gli emociti verdi sono attratti dall'epitelio ferito, seguiti da una migrazione a distanza. La fotoconversione sposta alcuni emociti dal verde al rosso, facilitando il loro tracciamento del movimento.

Protocollo

Questo protocollo consiste in quattro fasi principali sequenziali: (1) Preparazione degli stock di Drosophila e stadiazione delle pupe di Drosophila, (2) Dissezione e montaggio delle pupe, (3) Ferita delle pupe, (4) imaging confocale time-lapse in vivo.

1. Preparazione delle scorte di Drosophila e stadiazione delle pupe

1. Procurarsi ceppi appropriati di Drosophila (vedi Introduzione e Tabella dei Materiali).
2. Raccogli mosche giovani e adulte del genotipo appropriato.
   1. Seleziona i moscerini adulti utilizzando tamponi di gas di anidride carbonica per anestetizzare brevemente i moscerini e un pennello fine per trasferire i moscerini del genotipo o del sesso appropriato in una fiala di raccolta.
   2. Aggiungere 20 femmine vergini e 20 maschi a ciascuna fiala contenente terreni alimentari standard per mosche (una miscela di farina di mais, melassa e agar, vedere la Tabella dei materiali) integrati con lievito.
3. Per una generazione ottimale delle pupe, versare ogni giorno le mosche adulte su nuovo cibo in fiale fresche, mantenendo tutte le fiale a 25 °C.
   nota: Se il sistema Gal4-upstream activating sequence (Gal4-UAS) viene utilizzato per guidare l'espressione genica specifica del lignaggio, tutti i passaggi devono essere eseguiti a 25 °C o superiore, poiché il sistema Gal4-UAS è sensibile alla temperatura.
4. 18 ore prima della sessione di imaging programmata, selezionare almeno 10 pre-pupe bianche di nuova formazione (Figura 1A) dalle fiale (cioè 0 ore dopo la formazione del pupario, APF) utilizzando una pinza o un pennello fine per rimuovere le pupe dalla superficie interna della fiala e trasferire accuratamente le pupe sul lato di una fiala di plastica vuota pulita.
   nota: Le larve vaganti del 3^° stadio strisciano verso l'alto fuori dal mezzo alimentare per andare incontro a pupa; Le prepupe bianche di nuova formazione sono facilmente identificabili in quanto possiedono spiracoli anteriori estroflessi e sono stazionarie (a differenza delle larve del terzo stadio). La cuticola si trasforma nel 'pupario' (la custodia pupale) che inizialmente è morbido e bianco. È necessario prestare attenzione per evitare di danneggiare le pupe, poiché ciò può portare non solo a una risposta infiammatoria indotta da lesioni indesiderate, ma anche a un significativo ritardo dello sviluppo.
5. Invecchiare le pupe selezionate fino allo stadio di sviluppo appropriato (18 ore di APF daranno risultati ottimali) nella fiala a 25 °C.
   nota: Man mano che le pupe si sviluppano, l'involucro pupale diventerà progressivamente più scuro e fragile.
6. Preparare in anticipo gli altri reagenti per il passaggio successivo. Per fare la colla all'eptano, combinare 20 cm di nastro biadesivo arrotolato con 20 ml di eptano in una provetta da centrifuga da 50 ml, sigillare con il film di paraffina e far oscillare a temperatura ambiente per una notte sul banco.

2. Preparazione e dissezione di Drosophila pupe

1. Trasferisci le pupe di Drosophila messe in scena su un pezzo di nastro biadesivo montato su un vetrino. Posizionare le pupe in modo che il lato ventrale sia saldamente attaccato al nastro e il lato dorsale sia rivolto verso l'alto (Figura 1B).
   nota: La parte anteriore della pupa sarà identificabile dai due spiracoli che sporgono dall'estremità anteriore della custodia pupale.
2. Rimuovere con cautela le pupe dal loro involucro protettivo di pupario al microscopio da dissezione a campo chiaro utilizzando pinze e microforbici (Figura 1B-D).
   1. Inizialmente, praticare un'incisione nella regione più anteriore del pupario utilizzando il forcipe (Figura 1B). Assicurati che la custodia della pupa in quest'area sia cava e priva di tessuto pupale perché le pupe si saranno ristrette all'interno della custodia durante lo sviluppo precoce della pupa.
   2. Dopo questa incisione iniziale, strappare o tagliare con cura l'involucro della pupa in direzione antero-posteriore utilizzando una pinza o microforbici (Figura 1C) fino a quando la pupa non è completamente libera dall'involucro fragile opaco marrone (Figura 1D).
      nota: Le pupe in questa fase sono molto fragili e bisogna fare attenzione per evitare di perforare la superficie pupale; La perforazione è evidente poiché l'emolinfa fuoriesce rapidamente dal sito di puntura. Le pupe con forature, per quanto piccole, dovrebbero essere scartate.
3. Monta le pupe in un piatto con fondo di vetro usando la colla eptanica.
   1. Utilizzare un puntale per pipetta da 20 ml per posizionare una goccia da 10 ml di colla eptanica pre-preparata (vedere paragrafo 1.6 sopra) in una linea sul piatto con fondo di vetro.
   2. Lasciare asciugare la colla per 5 secondi prima di trasferire con cura le pupe sezionate sulla colla di eptano utilizzando una pinza (Figura 1E).
   3. Per facilitare l'osservazione e l'imaging, allineare le pupe in fila; si suggeriscono circa 5 pupe, ma altre saranno gestibili con l<>'esperienza. nota: L'uso della colla eptanica è consigliato quando si utilizzano sistemi di imaging verticali, ma non è necessario quando si utilizza un sistema invertito. Se la colla crea aberrazioni ottiche durante l'imaging, le pupe possono essere posizionate direttamente sul vetrino: l'adesione naturale tra il tessuto pupale e il vetro sarà sufficiente nella maggior parte dei casi per un imaging stabile, purché si presti attenzione quando si sposta la capsula di imaging tra i microscopi.
4. Per ottenere i migliori risultati, montare le pupe in modo che l'ala sia piatta sul vetro di copertura con la maggior parte della superficie dell'ala a diretto contatto con il vetro di copertura (Figura 1F). Fai rotolare le pupe usando una pinza per cambiare la loro posizione e assicurarti che l'ala sia montata correttamente.
5. Per evitare la disidratazione del campione durante il periodo di imaging, aggiungere un pezzo di carta da filtro assorbente imbevuta di acqua distillata sul lato del piatto con fondo di vetro al termine del montaggio, facendo attenzione a non disturbare le pupe (Figura 1E). Coprite il piatto con un coperchio.
   nota: Le pupe sono ora pronte per ferire e imaging.

3. Ferita indotta dal laser delle ali pupali di Drosophila

1. Trasferire la capsula con fondo di vetro contenente le pupe montate su un microscopio a campo largo dotato di un sistema di ablazione laser regolabile.
   1. Utilizzare un laser per ablazione a impulsi UV raffreddato ad aria con pompaggio ad azoto sintonizzato a 435 nm - vedere la Tabella dei materiali per i dettagli; la lunghezza d'onda precisa della luce utilizzata per l'illuminazione viene selezionata dall'utente tramite una cella di colorante appropriata.
2. Utilizzando l'ottica a campo chiaro, regolare i controlli del tavolino del microscopio per localizzare l'ala pupale della prima pupa da ferire (Figura 1F).
3. Per ottenere risultati ottimali, utilizzare un obiettivo a immersione in olio 40X o 63X sia per l'imaging che per l'ablazione laser; assicurarsi che il liquido di immersione utilizzato (olio o glicerolo) sia coerente tra i sistemi di ablazione e di imaging. Regolare il microscopio per mettere a fuoco il piano dell'epitelio dell'ala pupale più vicino al vetrino coprioggetti (cioè mettere a fuoco la regione dell'epitelio da ferire) utilizzando la manopola di controllo della messa a fuoco fine.
4. Utilizzando le regolazioni del tavolino del microscopio, posizionare l'ala pupale in modo che l'area da ferire sia direttamente allineata con l'area target nota del laser di ablazione.
5. Utilizzare un vetrino attenuatore di densità di energia montato sul microscopio per regolare manualmente il livello di potenza della luce di ablazione.
   nota: Il cursore dell'attenuatore è dotato di arresti e righe a scatto per identificare il livello relativo di attenuazione e consentire l'uso di impostazioni riproducibili.
6. Utilizzando un comando manuale esterno del grilletto, attivare il laser di ablazione con un solo breve clic del grilletto per ottenere una ferita. Verificare la comparsa della bolla d'aria transitoria nel sito di ablazione poiché la ferita sarà normalmente accompagnata da essa. Verificare se la ferita indotta dal laser ha avuto successo utilizzando gli appositi filtri fluorescenti per visualizzare l'epitelio pupale.
   nota: Fare attenzione a evitare l'esposizione accidentale ai raggi laser poiché i riflessi del raggio possono causare gravi danni agli occhi o alla pelle.
7. Se l'insuccesso dell'insuccesso, variare il piano focale (spostando la messa a fuoco del microscopio leggermente al di sopra o al di sotto del livello focale corrente) e ripetere il singolo clic del grilletto dell'ablazione. In alternativa, aumentare gradualmente la potenza del laser utilizzando la slitta dell'attenuatore fino a raggiungere la dimensione della ferita desiderata.
8. Per variare la frequenza di ripetizione dell'impulso laser di ablazione, utilizzare la manopola della frequenza di ripetizione sul pannello di controllo posteriore (che modifica la frequenza da meno di 1 impulso/s fino a 60 Hz). Per una ferita ottimale, impostare la frequenza di ripetizione dell'impulso su 40 Hz.
9. Per generare ferite di diverse dimensioni, utilizzare la slitta dell'attenuatore di densità di energia per regolare manualmente il livello di potenza della luce di ablazione.
10. Astenersi dal ferire tutte le pupe montate e utilizzare queste pupe non ablate come controlli non feriti.
11. Per ottenere risultati coerenti, riallineare regolarmente il sistema di ablazione (utilizzando il relativo manuale operativo). Inoltre, pulire e riempire la cella del risonatore del colorante che controlla la lunghezza d'onda dell'uscita del laser.

4. Imaging confocale time-lapse in vivo

1. Trasferire rapidamente il piatto con fondo di vetro su un microscopio appropriato per l'imaging time-lapse.
   nota: Per ottenere risultati ottimali, utilizzare un microscopio confocale o a disco rotante di alta qualità dotato di rivelatori sensibili in grado di rilevare sia la proteina fluorescente verde (GFP) che i fluorofori mCherry.
2. Per visualizzare l'intera ala pupale, utilizzare un obiettivo a basso ingrandimento (ad es. 20X) (Figura 2A). Per visualizzare la riparazione della ferita e la relativa risposta infiammatoria con un'elevata risoluzione spaziale, utilizzare le lenti dell'obiettivo a immersione in olio 40X (NA 1.3) o 63X (NA 1.4) (vedere le immagini rappresentative nella Figura 2B-D).
3. Aprire il software di acquisizione delle immagini appropriato associato al microscopio.
4. Utilizzando il software di acquisizione delle immagini, accendere i laser appropriati, ad esempio i laser a 488 nm e 561 nm, per visualizzare rispettivamente i fluorofori GFP e mCherry (facendo clic nelle relative caselle) e regolare la potenza del laser e le impostazioni di guadagno/offset per fornire un segnale fluorescente sufficiente evitando la saturazione dei pixel; utilizzare la potenza laser più bassa possibile (nell'intervallo 5 - 20%) per ridurre al minimo il fotobleaching e la fototossicità.
5. Per catturare sia l'epitelio riparatore che il reclutamento delle cellule infiammatorie, impostare il microscopio in modo che registri uno z-stack utilizzando le manopole di regolazione fine della messa a fuoco sul pannello di controllo; per risultati ottimali, impostare il software (utilizzando i clic manuali dei pulsanti) per registrare le z-slice attraverso l'ala pupale (minimo ogni 3 mm), dalla parte superiore dell'epitelio ferito fino allo spazio extracellulare sottostante (contenente gli emociti in migrazione) per ottenere un ampio z-stack (nell'intervallo da 50 a 100 mm).
6. Per l'imaging time-lapse, registrare gli z-stack a intervalli di tempo regolari (minimo ogni 30 s) per almeno 1 ora dopo la carica.
   nota: L'esatto intervallo di tempo tra gli z-stack scelti rappresenta un compromesso tra l'acquisizione delle dinamiche cellulari in rapida evoluzione e l'evitare il foto-sbiancamento dei campioni.
7. Per visualizzare contemporaneamente più pupe (compresi i controlli non avlati non ablati), utilizzare un tavolino motorizzato (collegato al microscopio) e la funzione di acquisizione multiposizione disponibile all'interno del software di imaging. Impostare manualmente la posizione di ogni pupa all'interno del software utilizzando le manopole di controllo della posizione del palco e quindi impostare manualmente i limiti z-stack appropriati (superiore e inferiore) per ogni pupa.
8. Visualizzate le immagini time-lapse durante l'acquisizione delle immagini o in un secondo momento con un software specializzato per l'analisi delle immagini (come ImageJ) utilizzando proiezioni z-stack o rendering 3D. Ad esempio, per seguire i movimenti dei singoli emociti (come nella Figura 2C' e D'), tracciare i nuclei degli emociti utilizzando i plug-in ImageJ ad accesso aperto "TrackMate" o "Manual Tracking" (metodi pubblicati in).
9. Utilizzare sonde fotoconvertibili (come Kaede) per fotoconvertire ed etichettare selettivamente un sottoinsieme di cellule epiteliali o immunitarie durante l'imaging.
   1. Aprire gli appositi moduli all'interno del software di imaging per eseguire la fotoconversione (come il modulo di recupero della fluorescenza dopo il fotobleaching (FRAP) e il modulo di recupero della fluorescenza dopo il photo-bleaching) e attivare il laser a 405 nm (cliccando nell'apposito box del software).
   2. Seleziona le celle da fotoconvertire all'interno del software FRAP utilizzando lo strumento di selezione quadrato, circolare o a mano libera. All'interno del software FRAP, impostare l'andamento temporale per la fotoconversione (sbiancamento) su una singola iterazione/fotogramma e impostare il laser a 405 nm al 20% della potenza laser. Fai clic manualmente su Avvia l'esperimento per eseguire la fotoconversione.
   3. Uscire dal modulo FRAP (fare clic su Chiudi) e tornare alla schermata di imaging originale all'interno del software; utilizzare i laser a 488 nm e 561 nm per visualizzare il comportamento delle celle fotoconvertite e non fotoconvertite impostando uno z-stack e una registrazione time-lapse come sopra.
      nota: Le sonde fotoconvertite rimangono stabili per molte ore dopo la fotoconversione iniziale, consentendo di seguire il comportamento delle celle fotoconvertite nel tempo (per almeno 5 ore). Ad esempio, le cellule infiammatorie nella ferita possono essere fotoconvertite selettivamente (Figura 2F) e il loro comportamento può essere seguito mentre si risolvono dal sito della lesione (Figura 2G e H).

Risultati

Figura 1: Preparazione della pupa di Drosophila per la ferita e l'imaging dal vivo. (A) Prepupe bianche di Drosophila raccolte a 0 h APF, con l'estremità anteriore indicata da appendici respiratorie estroflesse (spiracoli). (B) Dopo aver allevato prepupe APF bianche 0h per 18 ore a 25 °C, il pupario appare marrone. La dissezione del caso pupale dovr...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Azioni di Drosophila
Onnipresente E-caderina marcata GFP; Ubi-p63E-shg.GFP; (chrII)	Centro Azionario di Kyoto, DGRC	#109007	Le sequenze del promotore Ubi-p63E guidano l'espressione di Drosophila E-caderina (fucile da caccia) marcata all'estremità C-terminale con GFP.
Onnipresente E-caderina con tag GFP; Ubi-p63E-shg.GFP (III)	Centro di stoccaggio di Drosophila di Bloomington (Università dell'Indiana)	#58742	Le sequenze del promotore Ubi-p63E guidano l'espressione di Drosophila E-caderina (fucile da caccia) marcata all'estremità C-terminale con GFP.
Ubiquitario Moesin con tag GFP P{sGMCA}3.1	Centro di stoccaggio di Drosophila di Bloomington (Università dell'Indiana)	#59023	Il promotore/potenziatore sqh espresso in modo ubiquitario guida l'espressione di un frammento di Moesin (che include le sequenze di legame dell'actina) marcato con GFPS65T.
Driver specifico per l'emocita serpente-Gal4 ; srp-Gal4;	Generato da Katja Bruckner	Generato da Katja Bruckner	L'espressione di Scer\GAL4 fusa con una coda di poliA è controllata da 2 sequenze genomiche provenienti da monte di Drosophila serpent. Rif: Brückner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C.M., Rørth, P., Perrimon, N. Il recettore PDGF/VEGF controlla la sopravvivenza delle cellule del sangue in Drosophila. Cellula di sviluppo. 7 (1), 73–84, doi: 10.1016/j.devcel.2004.06.007 (2004).
UAS-nucleareRFP w1118;; P{UAS-RedStinger}6	Centro di stoccaggio di Drosophila di Bloomington (Università dell'Indiana)	#8545 o #8547	Le sequenze regolatorie UAS guidano l'espressione della forma DsRed.T4 di RFP che è marcata all'estremità C-terminale con un segnale di localizzazione nucleare
UAS-GFP citoplasmatica ;; P{UAS-GFP. S65T}	Centro di stoccaggio di Drosophila di Bloomington (Università dell'Indiana)	Più stock disponibili (es. #1522)	Espressione della versione S65T della GFP da parte di sequenze regolatorie UAS; la variante S65T mostra una maggiore luminosità.
UAS-fotoconvertibileKaede w1118;; P{UAS-Kaede.A}3	Centro di stoccaggio di Drosophila di Bloomington (Università dell'Indiana)	#26161	La proteina Kaede emette una fluorescenza verde brillante dopo la sintesi, ma cambia in modo efficiente in una fluorescenza rossa brillante stabile durante l'irradiazione con i raggi UV.
Spaghetti di zucca con tag GFP w1118;; P{sqh-GFP.RLC}	Centro di stoccaggio di Drosophila di Bloomington (Università dell'Indiana)	#57145	La regione codificante sqh, che è marcata all'estremità C-terminale con un tag T:Avic\GFPS65T, è espressa sotto il controllo del promotore sqh naturale.
Ingredienti per terreni di alimentazione per mosche			I terreni di alimentazione per mosche sono realizzati secondo le procedure standard (vedi Greenspan, R. 1997. Spingere le mosche: la teoria e la pratica della genetica della Drosophila. Cold Spring Harbor Press. 1-191 pp.)
mais	Wild Oats, Bristol, Regno Unito (o fornitore equivalente)	Contatta il fornitore direttamente	organico
Farina di soia	Wild Oats, Bristol, Regno Unito (o fornitore equivalente)	Contatta il fornitore direttamente	organico
Estratto di malto	Wild Oats, Bristol, Regno Unito (o fornitore equivalente)	Contatta il fornitore direttamente	organico
melassa	Wild Oats, Bristol, Regno Unito (o fornitore equivalente)	Contatta il fornitore direttamente	organico
Difco agar	BD Bioscienze, Fisher Scientific	DF0142-15-2	Per la preparazione di cibo per mosche
Acido propionico	sigma	402907	Per la preparazione di cibo per mosche
Nipagen	sigma	Codice 79721	Per la preparazione di cibo per mosche
Lievito di birra essiccato	Redstar, Dutscher Scientific, UK LTD	Redstar, Dutscher Scientific, UK LTD	Per la preparazione di cibo per mosche
Preparazione e montaggio del campione
Parafilm	sigma	P7793-1EA	Per la preparazione della colla eptanica
Pennello di zibellino fine	Daler-Rowney (o equivalente)	#0 o 1
forcipe	Fisher Scientific (o strumenti di scienze fini)	NC9404145	Dumont #5
Dischi con fondo in vetro per l'imaging	MatTek	P35G-0-10-C	Si consiglia di utilizzare piastre di Petri da 35 mm, con almeno un Microwell da 10 mm, vetro di copertura da 0,085-0,13 mm, non rivestito. Le piastre con micropozzetti più grandi consentiranno di montare e visualizzare un numero crescente di pupe in un singolo esperimento.
eptano	sigma	51730-5ML	Per la preparazione della colla eptanica
Nastro biadesivo (es. Scotch)	Agar Scientifico	AGG263	Per la preparazione della colla eptanica
Tubo da 50 ml (per colla eptanica)	Tubi Falcon di Fisher Scientific	14-432-22	Per la preparazione della colla eptanica
Vetrini per microscopio in vetro	Agar Scientifico	AGL4244	Per la dissezione di pupe di Drosophila
Stereomicroscopio da dissezione con campo chiaro	Leica (o equivalente)	M50	Per la dissezione di pupe di Drosophila
Microforbici	John Weiss International	103123	Forbici da ricerca in miniatura (dritte)
Ablazione laser e imaging
Laser per ablazione con nitogeno	Spectra-Physics (o Andor equivalente)	Modello VSL-337ND-S	Per le ferite, questo dovrebbe essere collegato a un sistema di imaging a campo largo
Microscopio confocale a scansione laser multilaser (CLSM)	Leica (o equivalente)	TCS AOBS SP8 o SP5-II collegato a un microscopio a epifluorescenza invertita Leica DMi8 (o equivalente)	Idealmente include uno stadio motorizzato per la scansione multi-sito e "a mosaico", oltre a rivelatori GaAsP "ibridi" (che offrono una sensibilità molto maggiore e l'aumento del segnale basso)
Camera climatica	Servizi di imaging Life (o equivalente)	"Sistema di controllo della temperatura del microscopio"	Collegato al microscopio confocale per il controllo della temperatura durante l'imaging
Software di analisi delle immagini
Modulo software FRAP	Leica (o equivalente)	Modulo software CLSM FRAP	Per l'esecuzione di fotoconversione di fluorofori fotoconvertibili come Kaede
ImageJ (software di analisi delle immagini)	Istituti Nazionali di Sanità (NIH)	https://imagej.nih.gov/ij/	Schneider, C.A., Rasband, W.S., Eliceiri, K.W. "NIH Image to ImageJ: 25 anni di analisi delle immagini". Metodi della natura 9, 671-675, 2012.
Plugin ImageJ "Tracciamento manuale"	Istituti Nazionali di Sanità (NIH)	https://imagej.net/Manual_Tracking
Plug-in ImageJ "TrackMate"	ImageJ, NIH	https://imagej.net/TrackMate	Tinevez, JY.; Perry, N. & Schindelin, J. et al. (2016), "TrackMate: una piattaforma aperta ed estensibile per il tracciamento di singole particelle.", Metodi 115: 80-90, PMID 27713081
Volocity (software di imaging 3D ad alte prestazioni)	Perkin Elmer	Volocity 6,3	Per l'analisi delle immagini
IMARIS (software di analisi delle immagini)	Piano bit	IMARIS per Biologi Cellulari	Per l'analisi delle immagini