Un test di aderenza all'opsono per valutare l'opsonizzazione dei batteri incapsulati da parte degli anticorpi anti-capsula

Abstract

Fonte: Chua, J., et al. Opsono-Adherence Assay per valutare gli anticorpi funzionali nello sviluppo di vaccini contro il Bacillus anthracis e altri agenti patogeni incapsulati. J. Vis. Exp. (2020)

Questo video dimostra un test di aderenza all'opsono per esaminare l'interazione tra batteri opsonizzati e cellule immunitarie. I batteri marcati in fluorescenza, trattati con siero di prova contenente anticorpi anti-capsula, vengono incubati con macrofagi. Dopo aver colorato i macrofagi con la fluorescenza, i batteri attaccati sulla superficie dei macrofagi vengono osservati al microscopio per la visualizzazione.

Protocollo

1. Coltura batterica e preparazioni

NOTA: La specie batterica utilizzata in questo protocollo è un ceppo virulento incapsulato, B. anthracis Ames. Tutte le manipolazioni con questa specie richiedono adeguate autorizzazioni di biosicurezza e di protezione e devono essere eseguite in una cabina di sicurezza biologica di Classe II o Classe III situata in un laboratorio BSL-3. Seguire le procedure operative istituzionali per il lavoro BSL-3 e per l'uso di dispositivi di protezione individuale durante la manipolazione dei batteri.

1. Preparare il brodo Brain Heart Infusion (BHI) sciogliendo 37 g di polvere di BHI in 1 L di acqua e sterilizzando in autoclave a 121 °C per 15 minuti. Conservare il brodo a temperatura ambiente.
2. Preparare una soluzione di bicarbonato di sodio all'8% in acqua e sterilizzare utilizzando una siringa filtrante da 0,20 μm. Conservare la soluzione a 4 °C e consumare entro 1 giorno.
3. Mescolare 8 g di brodo nutriente, 3 g di estratto di lievito e 15 g di agar agar in 1 litro di acqua per preparare le piastre di agar NBY. Autoclavare a 121 °C per 15 min. Versare in piastre di Petri e lasciare solidificare. Conservare le piastre a 4 °C.
   nota: Le piastre di agar NBY possono essere realizzate con o senza bicarbonato di sodio. L'aggiunta di bicarbonato di sodio alle piastre di brodo e agar induce la crescita di colonie mucoidi costituite da bacilli incapsulati. La concentrazione finale di bicarbonato di sodio sia in mezzi liquidi che solidi è dello 0,8%.
4. Preparare il brodo di coltura per B. anthracis mescolando il 50% di brodo BHI autoclavato, il 40% di FBS e il 10% di soluzione di bicarbonato di sodio (v/v).
   nota: Questo brodo è formulato per produrre catene corte di bacilli incapsulati.
5. Preparare una piastra master di B. anthracis striandola per isolarla su una piastra di agar NBY da un brodo di spore un giorno prima di coltivarla in brodo. Incubare a 37 °C.
6. Inoculare 30 ml di brodo di coltura in un pallone ventilato da 250 ml con diverse colonie di B. anthracis.
   nota: Uno specifico rapporto volume/superficie del brodo, come specificato qui, è necessario per produrre bacilli incapsulati al massimo.
7. Agitare il brodo di coltura a 125 giri/min, 37 °C con il 20% di CO₂ e umidità per 18-24 h.
   nota: La coltivazione di B. anthracis a temperature superiori a 37 °C può inibire la produzione di capsule.
8. Utilizzare una colorazione negativa con inchiostro di china per garantire un incapsulamento sufficiente e che i bacilli siano in catene corte (1-5 bacilli/catena) prima della fissazione (vedere paragrafo 2).
9. Per determinare le unità formanti colonie (CFU), diluire in serie 100 μL di coltura 1:10 in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e diluizioni di coltura su piastre di agar di sangue di pecora. Incubare per 12-18 ore a 37 °C. Contare le CFU e determinare il numero di batteri per mL di coltura.
   nota: Il conteggio può essere eseguito anche utilizzando un emocitometro al microscopio una volta che i batteri sono stati fissati. Tuttavia, questo non è raccomandato perché i bacilli sono difficili da vedere a basso ingrandimento.
10. Aggiungere il 16% di paraformaldeide (PF) all'intero volume di coltura batterica a una concentrazione finale del 4% di PF per fissare i bacilli. Agitare lentamente su uno shaker a temperatura ambiente per 7 giorni.
    nota: Sette giorni di incubazione in PF al 4% si basano sulla procedura operativa standard dell'United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases (USAMRIID) per il fissaggio dei bacilli vegetativi.
11. Per rimuovere il fissativo e testare la sterilità, lavare tre volte 4 mL (10% in volume) di sospensione batterica fissata in una provetta conica da 50 mL mediante centrifugazione a ≥3000 x g per 45 minuti e utilizzando 30 mL/lavaggio con PBS. Conservare il campione rimanente in 4% PF a 4 °C.
    nota: Dopo la pellettatura, il pellet batterico è soffice a causa della presenza di una capsula. Fare attenzione a non disturbare il pellet durante il lavaggio. È necessario rimuovere tutto il fissativo in modo che non interferisca con il test di vitalità. Se necessario, aumentare il numero di lavaggi.
12. Per il test di vitalità, inoculare 40 mL di un terreno di crescita batterico (ad es. brodo BHI) con 4 mL di sospensione lavata (≤ 10% del volume del brodo) e incubare a 37 °C per 7 giorni. Controllare la densità ottica a 600 nm prima e dopo 7 giorni per misurare la torbidità.
13. Dopo 7 giorni di incubazione in brodo, impiattare ≥100 μL di brodo su una piastra di agar e incubare per altri 7 giorni. Se non si osserva alcun aumento della torbidità e nessuna crescita sulle piastre, la coltura originale è considerata sterile e può essere trasferita a un laboratorio BSL-2.
    NOTA: Il Federal Select Agent Program impone che il B. anthracis inattivato possa essere trasferito dai laboratori BSL-3 solo dopo aver dimostrato la completa sterilità del campione. Il test di vitalità per B. anthracis inattivato consiste nella coltura del 10% del campione in brodo per 7 giorni, seguita da una coltura su un terreno solido per altri 7 giorni. Seguire le linee guida istituzionali per ricevere l'approvazione del trasferimento una volta stabilita la sterilità.         

2. Colorazione negativa e microscopia ottica per osservare l'incapsulamento e le catene di bacilli

1. Mescolare 5 μl di sospensione batterica con 2 μl di inchiostro di china su un vetrino da microscopio. Posizionare un vetro di copertura spesso 1 o 1,5 μm sopra la sospensione senza creare bolle.
   nota: Lo smalto per unghie può essere utilizzato per sigillare il vetro di copertura sul vetrino.
2. Osservare la sospensione batterica utilizzando un obiettivo a olio da 40x a 100x su un microscopio ottico. Assicurarsi che i bacilli siano incapsulati osservando una zona di eliminazione (capsula esclusa l'inchiostro di china) che circonda ciascun batterio e che le catene dei bacilli siano corte.

3. Marcatura FITC dei batteri

1. Sciogliere l'isotiocianato di fluoresceina (FITC) in dimetilsolfossido alla concentrazione di 2 mg/mL.
2. Misurare il volume del ceppo batterico inattivato.
3. Lavare il calcio 3 volte in PBS per rimuovere il fissativo.
4. Aggiungere la soluzione FITC alla concentrazione finale di 75 μg/mL. Agitare lentamente la miscela per 18-24 ore a 4 °C.
5. Lavare tre volte i batteri pellettandoli a ≥3000 x g, 45 minuti e utilizzando 30 ml di PBS/lavaggio per rimuovere la FITC in eccesso. Assicurarsi che il pellet soffice non venga disturbato durante il lavaggio. Risospendere i bacilli in PBS allo stesso volume iniziale.
6. Aliquotare e conservare i bacilli in microprovette a -20 °C fino al momento dell'uso. Non congelare/scongelare i bacilli più volte poiché i bacilli potrebbero perdere la loro capsula.

4. Opsonizzazione batterica

1. Il calore inattiva un piccolo volume di sieri di prova (da primati non umani, NHP) a 56 °C per 30 minuti in un blocco termico.
2. Scongelare e lavare i batteri marcati con FITC con PBS 2x pellettando a 15000 x g per 3-5 minuti. Risospendere in PBS allo stesso volume iniziale.
3. In una piastra inferiore rotonda a 96 pozzetti (piastra #2), diluire in serie i sieri di prova in terreno cellulare. In un'altra piastra inferiore rotonda da 96 pozzetti (piastra #3), aggiungere 10 μL di sieri di prova diluiti in ciascun pozzetto.
   nota: In ogni piastra, PBS e sieri di scimmia normali sono stati inclusi al posto dei sieri di prova diluiti come controlli negativi. Abbiamo anche scelto un siero di prova come controllo positivo per generare una curva standard per normalizzare tutti i test eseguiti in giorni diversi. Il siero del test di controllo positivo è stato scelto arbitrariamente perché era abbondante.
4. Alla piastra #3, aggiungere 10 μL di complemento di coniglietto appena ricostituito.
   nota: Una volta ricostituito, scartare il restante complemento di coniglietto; Non ricongelare e scongelare.
5. Alla piastra #3, aggiungere il volume appropriato di bacilli marcati con FITC per una molteplicità di infezioni di 1:20. Ad esempio, aggiungi il volume che contiene 5 x 10⁴ x 20 bacilli per 5 x 10⁴ cellule. Rabboccare ogni pozzetto nella piastra #3 con il volume appropriato di terreno cellulare per un totale di 105 μL.
   nota: La piastra #1, che contiene cellule, riceve 100 μL di batteri opsonizzati con i restanti 5 μL come volume vuoto. Abbiamo testato ogni diluizione dei sieri di prova in duplicato.
6. Incubare la piastra #3 a 37 °C per 30 minuti in presenza del 5% di CO₂ con umidità per opsonizzare i bacilli.

5.Saggio di aderenza e marcatura fluorescente di cellule di mammifero

1. Mantenere tutti i reagenti a 37 °C prima dell'uso.
2. Posizionare la piastra #1, che contiene celle aderenti, su un blocco termico a 37 °C.
3. Utilizzare un pipettatore multicanale per rimuovere il terreno esaurito dai pozzetti e sostituirlo rapidamente con 100 μL di batteri opsonizzati dalla piastra #3. Assicurarsi che non siano state generate bolle nei pozzetti durante il pipettaggio. Incubare la piastra #1 a 37 °C con il 5% di CO₂ e umidità per 30 minuti per farla aderire.
4. Lavare ogni pozzetto 5 volte con 150 μL di PBS sopra un blocco termico a 37 °C per rimuovere i bacilli non attaccati.
   nota: Bisogna fare attenzione a non disperdere accidentalmente le cellule durante il lavaggio.
5. Diluire il 16% di PF con PBS 1:4 per ottenere il 4% di PF. Fissare le celle con il 4% di PF per 1 ora aggiungendo 150 μL a ciascun pozzetto. Celle di lavaggio 2 volte con PBS.
6. Mescolare 2 μL di HCS (screening ad alto contenuto) di Orange Cell Stain in 10 mL di PBS. Aggiungere 150 μl di questa soluzione colorante alle celle fisse e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
7. Lavare i pozzetti 2 volte con PBS.
8. Conservare a 4 °C fino al microscopio.

6. Microscopia

NOTA: In generale, un microscopio a fluorescenza automatizzato ad alta produttività faciliterà l'imaging per l'OAA. Se non è disponibile un sistema automatizzato, è possibile acquisire manualmente immagini fluorescenti dei bacilli aderenti. In questo studio, i bacilli aderenti e i monostrati cellulari sono stati visualizzati utilizzando il sistema di microscopia a scansione laser Zeiss 700 con apparecchiature specializzate; il nostro sistema era composto dal microscopio invertito Zeiss Axio Observer Z1 dotato di tavolino automatizzato, dal modulo Definite Focus, dall'obiettivo 40 x NA 0.6, dalla fotocamera Axio Cam HRc e dal software Zen 2012 (Blue Edition). Le immagini acquisite sono immagini a campo largo, non immagini confocali. Il seguente protocollo è inteso come una configurazione di base del microscopio applicabile a una varietà di sistemi di microscopia automatizzati.

1. Incubare la piastra #1 a temperatura ambiente per 30 minuti. Accendere il microscopio e l'attrezzatura correlata.
   nota: L'acclimatazione a temperatura ambiente impedisce la formazione di condensa sulla lastra di vetro durante l'imaging. Inoltre, previene la sfocatura dovuta agli sbalzi di temperatura.
2. Posiziona la piastra sul tavolino e metti a fuoco le cellule utilizzando un campo chiaro o un contrasto di fase.
3. Selezionare il formato a 96 pozzetti come impostazione della piastra. Seleziona le impostazioni del canale.
   nota: La lunghezza d'onda di picco di eccitazione ed emissione di FITC è di 495/519 nm; le colorazioni delle cellule arancioni HCS sono 556 e 572 nm. A seconda dei filtri disponibili sul microscopio, possono essere utilizzati altri fluorofori.
4. Selezionare l'impostazione su Modalità piastrella. Indicare il numero di immagini da acquisire.
   nota: La funzione di affiancamento consente l'acquisizione di più posizioni in un pozzetto di campionamento e può essere impostata per acquisire un'immagine in un formato di affiancamento o casuale. Abbiamo ripreso 10 aree casuali per pozzo.
5. Cambia la modalità di acquisizione in "bianco e nero" o "monocromatico" e il binning ≥ 2x2.
   nota: L'impostazione del binning da 1x1 a 2x2 o 4x4 aumenterebbe la velocità della microscopia, ma comporterebbe anche una risoluzione inferiore dell'immagine. Per l'OAA, è sufficiente utilizzare queste impostazioni poiché il test enumera sia i macrofagi che i batteri aderenti.
6. Attivare l'autofocus o il modulo di messa a fuoco. Indicare la frequenza con cui deve essere eseguita la funzione di messa a fuoco automatica. Attiva la funzione Z stack, se disponibile. Indicare il numero di pile Z che cattureranno lo spessore del monostrato cellulare e dei bacilli aderenti.
   nota: Il numero di stack Z scelti aumenterà il tempo di microscopia, ma garantirà che venga scattata un'immagine con la messa a fuoco corretta in ogni stack Z.
7. Designa una cartella di file in cui salvare le immagini. Eseguire il programma di imaging automatizzato.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Filtro per siringa da 0,20 μm (25 mm, cellulosa rigenerata)	Corning, Corning, NY	431222
Siringa da 10 ml (punta Luer-Lock)	BD, Franklin Laghi, NJ	302995
Piastre nere da 15μ a 96 pozzetti (piastra #1 per imaging)	In vitro scientifico, Sunnyvale, CA	P96-1-N
16% paraformaldeide	Scienza della microscopia elettronica, Hatfield, PA	Codice: 15710
Pallone trattato per coltura tissutale da 75 cm quadrati	Corning, Corning, NY	430641
Agar (polvere)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	E 1296
Complemento Coniglietto	Cedarlane Labs, Burlington, Carolina del Nord	CL3441
Estratto di lievito Bacto	BD, Scintille, MD	Codice 288620
BBL Brain Infusione Cardiaca (BHI)	BD, Scintille, MD	211059
Piastre Blood Agar (TSA con sangue di pecora)	Remel, Lenexa, KS	R01198
Raschietto per celle	Sarstedt, Newton, Carolina del Nord	83.183
Piastre per colture cellulari Costar a 96 pozzetti (piastre #2 e 3 per diluizioni)	Corning, Corning, NY	3596
Vetro di copertura	Scienza della microscopia elettronica, Hatfield, PA	Codice: 72200-10
Difco Brodo Nutriente	BD, Scintille, MD	Codice 234000
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), alto glucosio	Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	Codice 11965-092	Contiene 4500 mg/L di glucosio, 4 mM di L-glutammina, rosso fenolo
EVOS FL Auto Cell Imaging System (microscopio a fluorescenza)	Tecnologie per la vita, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	AMAFD1000
Siero fetale bovino	Hyclone, GE Healthcare Scienze della vita, South Logan, UT	SH30071.03	Non irradiato con raggi gamma, non inattivato dal calore
Isotiocianato di fluoresceina	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	F143
HCS Cell Mask Colorazione cellulare arancione	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	H32713
emocitometro (Neubauer migliorato)	Hausser Scientific, Horsham, Pennsylvania	3900
Soluzione India Ink	BD, Scintille, MD	261194
L-glutammina (200 mM)	Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA	25030081	Integrare il terreno con 2 mM di L-glutammina aggiuntivi
Nikon Eclipse TE2000-U (microscopio composto invertito)	Nikon Instruments, Melville, NY	TE2000
PBS senza calcio o magnesio	Lonza, Walkersville, MD	17-516F
Soluzione di penicillina-streptomicina, 100x	Hyclone, GE Healthcare Scienze della vita, South Logan, UT	SV30010
Piastre di Petri (100 x 15 mm)	Falcon, Corning, Durham, Carolina del Nord	351029	Per piastre di agar
Linea cellulare di macrofagi RAW 264.7 (Tib47)	ATCC, Manassas, VA	ATCC TIB-71
Diapositive	VWR, Radnor, PA	Codice 16004-422
bicarbonato di sodio	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	Episodio 5761
Soluzione di blu di tripano (0,4%)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T8154
Microscopia a scansione laser Zeiss 700 (microscopio confocale)	Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY	4.109E+15