Valutazione dell'attivazione controllata delle cellule T con un peptide MHC fotoattivabile

Abstract

Fonte: Sanchez, E., et al. Controllo spaziale e temporale dell'attivazione delle cellule T utilizzando un agonista fotoattivabile. J. Vis. Exp. (134), (2018)

Questo video mostra un metodo per dedurre un complesso di istocompatibilità peptide-maggiore fotoattivabile utilizzando l'irradiazione UV. Il processo di deforestazione espone la sequenza peptidica nativa, consentendo un'attivazione precisa delle cellule T.

Protocollo

1. Preparazione delle superfici di vetro stimolatorie

1. Rivestire il vetro coprioggetto a otto pozzetti con poli-L-lisina biotinilata (Bio-PLL) diluita 1:500 in acqua distillata e deionizzata (ddH₂O). Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (RT).
2. Lavare con H₂O.
3. Asciugare per 2 ore a RT.
4. Bloccare le superfici rivestite di Bio-PLL con tampone bloccante (soluzione salina tamponata HEPES [10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl], con 2% BSA) per 30 minuti a RT.
   1. Sciogliere 5 mg di bromidrato di poli-L-lisina in 1 mL di 10 mM di NaPO4, pH 8,5.
   2. Aggiungere 125 μmol (0,55 mg) di NHS-biotina (da uno stock di 100 mg/mL in DMSO) e controllare il pH della reazione. Se il pH è inferiore a 8,5, aggiungere 2 μL di NaOH 4 N per portarlo a un pH compreso tra 8,5 e 9,5.
   3. Vortice per 30 min.
   4. Estinguere la reazione con 50 μL di glicina 100 mM disciolta in 20 mM Tris pH 8.0.
   5. Girare alla massima potenza per 10 minuti e trasferire il surnatante in un nuovo tubo.
      NOTA: La qualità del Bio-PLL viene tipicamente confrontata con le preparazioni precedenti rivestendo in serie due diluizioni del materiale su una piastra ELISA a 96 pozzetti e quantificando il contenuto di biotina dopo l'incubazione con streptavidina accoppiata a fosfatasi alcalina.
5. Rimuovere il buffer di blocco. Non lasciare che i pozzi si asciughino. Aggiungere streptavidina (100 μg/mL nel tampone bloccante). Incubare per 1 ora a 4 °C.
6. Lavare in HBS. Riempire e capovolgere i pozzetti di scorrimento della camera 4 - 5 volte, rimuovendo l'HBS dai pozzetti. Non lasciare che i pozzi si asciughino.
7. Aggiungere i ligandi biotinilati del pMHC e le molecole di adesione alla superficie.
   nota: MCC e OVA possono essere fotogabbiati aggiungendo gruppi protettivi a base di orto-nitrobenzile (ad esempio, nitrofeniletilico (NPE) o nitroveratrilossicarbonile (NVOC)) al gruppo ε-amminico delle lisine chiave (K12 in MCC, K7 in OVA). MCC e OAV fotogabbiati possono essere ottenuti da fornitori commerciali. Dopo la ricostituzione in tampone acquoso, vengono ripiegati in I-E^{k e} H2-K^b espressi battericamente utilizzando approcci consolidati.
8. Validazione di peptide MCC o OVA fotoattivabile
   1. Dedurre i peptidi protetti da NVOC mediante irradiazione UV con una lampada UV portatile (vedi Tabella dei materiali) per 20 minuti a RT.
   2. Pulsare 1,0 x 10⁵ APC con 1 μM di peptide non stimolante (controllo negativo, ad es. Hb), peptide fotoattivabile non irradiato, peptide fotoattivabile irradiato e peptide agonista (controllo positivo, ad es. MCC) per 1 ora per una notte a 37 °C.
   3. Per stimolare le cellule T che esprimono il 5C. C7/2B4/E TCR, utilizzare cellule B CH12 o CH27. Per stimolare le cellule T OT1, utilizzare le cellule timoma RMA-s o EL4.
   4. Miscelare le APC pulsate con un numero uguale di cellule T in piastre a fondo rotondo a 96 pozzetti a un volume finale di 200 μL. Incubare a 37 °C per 12 - 24 ore.
   5. Recuperare i surnatanti da ciascun pozzetto e analizzare IL-2 mediante ELISA con rivelazione colorimetrica di streptavidina-perossidasi di rafano.
      NOTA: Si raccomanda vivamente la conferma dello stato di ingabbiamento di tutti i peptidi mediante spettrometria di massa elettrospray prima del ripiegamento in complessi MHC.
9. Eseguire il ripiegamento e la purificazione dell'MHC in modo da ridurre al minimo l'esposizione alla luce. Ad esempio, avvolgere le reazioni di piegatura in un foglio di alluminio ed eseguire la cromatografia di filtrazione su gel con la lampada UV spenta.
   nota: È stato riscontrato che le MCC- I-E^k fotoattivabili e le OVA- H2-K^b inducono l'attivazione delle cellule T UV-indipendenti ad alta densità, probabilmente a causa di un incompleto ingabbiamento funzionale. Quindi, il pMHC fotoattivabile viene diluito in un eccesso di 10 - 30 volte di pMHC non stimolante (ad es. I-E^k contenente il peptide dell'emoglobina (Hb)) durante la fase di immobilizzazione. Ciò migliora il rapporto segnale/rumore del successivo esperimento di imaging.
10. Per fotoattivare le cellule T CD4⁺, utilizzare collettivamente una miscela di Hb-I-Ek biotinilato (3 μg/mL), MCC-I-E^k fotoattivabile biotinilato (0,1 μg/mL) e anticorpo biotinilato contro l'MHC H2-K^{k di} classe I (0,5 μg/mL). L'anticorpo^k anti-H2-K incoraggia il 5C. Le cellule C7/2B4/E T, che esprimono H2-K^k, si diffondono sulla superficie del vetro senza subire attivazione.
11. Per le cellule T CD8⁺, utilizzare una miscela di H2-Db biotinilato contenente il peptide KAVYDFATL (1 μg/mL), OVA-H2-Kb fotoattivabile biotinilato (0,1 μg/mL) e il dominio extracellulare della molecola di adesione ICAM-1 (2 μg/mL prodotta da coltura di cellule di insetti). L'ICAM-1 incoraggia la formazione di contatti stretti impegnando l'integrina LFA1 sulla superficie delle cellule T.
12. Applicare tutte le miscele proteiche nel tampone bloccante, quindi incubare per 1 ora a RT o almeno 2 ore a 4 °C.
    nota: La densità molecolare su superfici di questo tipo di ~8000 per μm2 è stata precedentemente determinata. Dato che il pMHC fotoattivabile rappresenta ~1/30 della proteina biotinilata sulla superficie, la sua densità sarà di ~267 molecole per μm2, prima del decaggio.
13. Lavare come al punto 1.6 e lasciare in HBS fino al momento dell'uso.
14. Aggiungere 200.000 cellule T CD4⁺ o CD8⁺ che esprimono il TCR appropriato in ciascun pozzetto e lasciare che le cellule aderiscano a 37 °C per 15 minuti. Una volta che le cellule si sono attaccate e si sono diffuse sulla superficie, sono pronte per la fotoattivazione e l'imaging.
    nota: La trasduzione retrovirale delle cellule T effettrici con sonde di imaging fluorescenti è descritta in dettaglio altrove. La segnalazione del calcio può essere studiata anche utilizzando cellule T non trasdotte caricate con il colorante sensibile al calcio Fluo-46. Il colorante raziometrico Fura-2 non è raccomandato perché richiede un'eccitazione nell'intervallo UV, che induce anche il decaggio del pMHC fotoattivabile.

2. Acquisizione di immagini

1. Per l'acquisizione delle immagini è possibile utilizzare un microscopio TIRF invertito dotato di un obiettivo 150X compatibile con i raggi UV. Irradiare con i raggi UV le regioni definite dall'utente utilizzando un sistema di diaframmi digitali collegato a una lampada al mercurio (HBO) da 100 W. Dirigere la luce UV di questa lampada sul campione utilizzando uno specchio a passaggio lungo da 400 nm.
2. Utilizza il software di analisi delle immagini per la fotoattivazione localizzata e l'acquisizione time-lapse. Nella maggior parte degli esperimenti, monitorare le sonde in entrambi i canali verde e rosso utilizzando laser di eccitazione rispettivamente a 488 nm e 561 nm. La luce laser viene diretta sul campione utilizzando uno specchio dicroico passa-banda doppio che trasmette anche nella gamma UV (per consentire il decaging). Si prega di consultare la Tabella dei materiali e la Figura 1 per ulteriori informazioni sulla configurazione del microscopio.
3. Dopo aver montato il vetrino della camera contenente le cellule T, regolare le impostazioni per ottenere l'illuminazione TIRF o a epifluorescenza, se necessario. In modalità live, selezionare un campo di celle che esprimono la sonda fluorescente o le sonde fluorescenti di interesse. Stabilisci regioni su scala micron per la fotoattivazione sotto le singole cellule utilizzando il controllo software.
4. Inizia l'acquisizione time-lapse. In genere, vengono acquisiti 80 punti temporali, con un intervallo di 5 s tra ogni punto temporale. Ciò lascia un tempo più che sufficiente per esposizioni sequenziali a 488 nm e 563 nm, nel caso di esperimenti a doppio colore.
5. Dopo 10 punti temporali, fotoattivare le regioni selezionate aprendo l'otturatore digitale a diaframma per 1 - 1,5 s.
6. Al termine del time-lapse, selezionare un nuovo campo di celle e ripetere il processo.

Risultati

Figura 1: Configurazione del microscopio per la fotoattivazione e l'imaging TIRF.

I laser da 488 nm e 561 nm vengono utilizzati rispettivamente per l'imaging TIRF e l'imaging in epifluorescenza di sonde verdi e rosse. La luce UV per la fotoattivazione viene prelevata da una lampada al mercurio (Hg) collegata a un sistema di diaframmi digitali in grado di illuminare piccole...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nunc Lab-Tek Vetro di copertura camerato	Thermofischer Scientific	155361
Bromidrato di poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	P2636	Dovrà produrre poli-L-lisina biotinilata
EZ-Link NHS-Biotina	Thermofischer Scientific	20217	Dovrà produrre poli-L-lisina biotinilata
Streptavidina	Thermofischer Scientific	434301
BirA-500: Kit di reazione standard BirA biotina-proteina ligasi	avidità	BirA500	Verrà utilizzato per biotinilare le proteine
Hb I-EK biotinilato			Per il ripiegamento delle proteine, vedere il riferimento 6. Per la biotinilazione, utilizzare il kit BirA
NPE-MCC I-EK biotinilato	Anaspec		L'NPE-MCC personalizzato (haneradliayl-k(Nvoc)-QATKOH) può essere acquistato da Anaspec
Anticorpo αH2-Kk biotinilato	BD Bioscienze	553591
NPE-OVA biotinilato H2-Kb	Anaspec		NPE-OVA personalizzato (H-SIINFE- K(Nvoc)-L-OH) può essere acquistato da Anaspec
biotinilato KAVY H2-DB	Anaspec		La proteina sintetizzata personalizzata (KAVYDFATL) può essere acquistata da Anaspec
ICAM1 biotinilato			Per il ripiegamento delle proteine, vedere il riferimento nel protocollo. Per la biotinilazione, utilizzare il kit BirA
Lampada UV portatile	UVP	UVGL-25	La lampada è tenuta < 1 cm dal campione. 30 s di luce a 365 sono sufficienti per un decaggio rilevabile, 20 minuti per un decaggio quantitativo.
Sistema Olympus IX-81 OMAC TIRF.	Olimpo		Ulteriori informazioni sul sistema di imaging sono disponibili nella Figura 6
Diaframma digitale a mosaico	Andor
Software per diapositive	Innovazioni di imaging intelligente