Valutazione della topologia immunologica delle sinapsi attraverso l'imaging di cellule vive

Abstract

Fonte: Martinelli, R. et al., Un modello di cellula planare endoteliale per l'imaging della dinamica immunologica delle sinapsi.J. Vis. Exp. (2015)

Questo video mostra l'imaging di cellule vive della topologia immunologica delle sinapsi, studiando le interazioni tra i linfociti T e le cellule epiteliali che trasportano antigeni fluorescenti. La microscopia a fluorescenza rivela lo spostamento del citoplasma rosso e gli anelli gialli della membrana nelle cellule endoteliali, indicando la formazione di sinapsi immunologiche.

Protocollo

1. Preparazione delle cellule T effettrici CD4⁺ Th1/memoria umane

1. Applicare un laccio emostatico sul braccio del donatore, pulire la vena con alcool e inserire un ago. Aspirare lentamente 15 ml di sangue in un vacutainer utilizzando l'EDTA come anticoagulante. Quando il sangue è stato prelevato, slegare il laccio emostatico prima di rimuovere l'ago. Applicare immediatamente pressione sulla ferita con una garza sterile quando l'ago viene rimosso.
2. Trasferire il sangue in una provetta da 50 ml. Aggiungere RPMI-1640 a RT con diluizione 1:1 (volume finale 30 ml). Sovrapporre con cura il sangue diluito su due provette da 50 ml contenenti 15 ml di terreno di isolamento dei linfociti prefiltrato come Ficoll-Paque a RT.
3. Centrifugare il gradiente a RT per 30 minuti a 1.200 x g in un rotore a secchiello oscillante. Durante la centrifugazione preparare il terreno delle cellule T (500 ml di RPMI-1640, 50 ml di FCS, 5 ml di penicillina/streptomicina).
4. Dopo aver rimosso la provetta da 50 ml dalla centrifuga, osservare quattro strati: un pellet di globuli rossi sul fondo, il paque, uno strato di cellule che contiene globuli bianchi (compresi i linfociti) e il plasma. Rimuovere con cautela lo strato di globuli bianchi con una pipetta Pasteur e trasferirlo in una provetta Falcon da 50 ml.
5. Lavare lo strato di globuli bianchi aggiungendo RT RPMI-1460 (fino a 20 ml) e centrifugare a RT per 5 minuti a 1.200 x g. Risospendere i globuli bianchi in 1 ml di terreno di coltura delle cellule T. Aggiungere 5 μl della sospensione cellulare da 1 ml a 250 μl di terreno di cellule T in una provetta da centrifuga da 1,5 ml e mescolare delicatamente su e giù con una pipetta.
6. Aggiungere 25 μl di sospensione cellulare diluita a 25 μl di blu di tripano allo 0,4%. Aggiungere 10 μl di miscela su ciascun lato di un emocitometro standard.
7. Posizionare l'emocitometro su un microscopio ottico a bassa potenza. Utilizzando un obiettivo 10X, contare il numero di cellule viventi che hanno escluso il colorante blu di tripano e sono presenti nel quadrato centrale di entrambi i lati dell'emocitometro.
8. Per calcolare la concentrazione cellulare, moltiplicare la media dei 2 quadrati per 100 (fattore di diluizione) e poi moltiplicare per 10⁴ per ottenere il numero di cellule/ml.
9. Regolare la concentrazione finale a 0,5 x 10⁶ cellule/ml in terreno di coltura a cellule T. Aggiungere alle cellule una concentrazione finale di 1 μg/ml ciascuno dei superantigeni batterici, stafilococco, enterotossina B (SEB) e tossina 1 della sindrome da shock tossico (TSST). Coltura per 72 ore (37 °C e 5% CO₂) per espandere la popolazione di cellule T CD4⁺.
10. Pellet di cellule T (1.200 x g, 5 min) e risospensione a 0,5 x 10⁶ cellule/ml in terreno di cellule T con l'aggiunta di IL-15 umana (20 ng/ml). Trasferire i linfociti in un matraccio T150. Continuare a espandere/dividere le cellule in pieno terreno di IL-15 ogni 24-48 ore secondo necessità (in base al colore del supporto; cioè, ogni volta che i media passano dal rosa al leggermente giallo) in seguito. Mantenere la popolazione linfocitaria risultante per un massimo di 15 giorni.
    nota: In base alla progettazione, questo protocollo attiverà ed espanderà in modo specifico un sottoinsieme di cellule T CD4⁺ che sono reattive a SEB e TSST e quindi le guiderà verso un fenotipo effettore/memoria simile a Th1. Altri globuli bianchi non riescono a sopravvivere e a crescere in queste condizioni, in modo tale che entro la fase 1.10 le cellule saranno almeno al 95% CD4⁺, CD45RO⁺, come può essere facilmente valutato mediante citometria a flusso. Se lo si desidera, è possibile ottenere un'ulteriore purificazione attraverso i kit di selezione positivi o negativi basati su anticorpi/biglie magnetiche disponibili in commercio.

2. Avvio della coltura primaria di cellule endoteliali umane

1. Rivestire un matraccio T25 con fibronectina (FN) 20 μg/ml in PBS in condizioni sterili. Lasciare in RT per 30-60 minuti. Rimuovere l'FN e aggiungere 5 ml di terreno completo (terreno basale endoteliale (EBM-2) integrato con quote singole di terreno di crescita endoteliale (EGM-2)). Pre-incubare in un incubatore per colture cellulari a 37 °C per almeno 30 minuti.
2. Scongelare una fiala di cellule endoteliali microvascolari umane congelate o dermiche (HLMVEC o HDMVEC) in un bagno d'acqua a 37 °C con una leggera agitazione occasionale per ~2-3 minuti. Trasferire immediatamente le cellule nel pallone T25 contenente terreno preriscaldato. Agitare delicatamente e riporre in un'incubatrice a 37 °C.
3. Sostituire il supporto dopo ~4-6 ore. Continuare a cambiare il supporto ogni 48 ore circa (o quando il supporto diventa leggermente giallo) fino a quando la lastra raggiunge la confluenza di ~90-95%.

3. Scissione ed espansione generale delle cellule endoteliali

1. Coltiva le cellule fino a ~90-95 confluenza. Questo potrebbe richiedere 2-5 giorni. Per la divisione, rimuovere il supporto e risciacquare con PBS. Rimuovere la PBS e sostituirla con un volume minimo di 1x tripsina fresca (0,5 ml per T25 o 1,5 ml per T75). Agitare delicatamente per coprire tutte le superfici con tripsina. Incubare a 37 °C per ~5 min. Monitorare il distacco delle cellule dalla piastra utilizzando un microscopio ottico a bassa potenza.
2. Quando la maggior parte delle cellule appare arrotondata o staccata, aggiungere 5 volumi (cioè rispetto al volume di tripsina aggiunto) di terreno EGM-2 completo preriscaldato e pipettare delicatamente sulla superficie del pallone per staccare tutte le cellule.
3. Contare le cellule endoteliali con un emocitometro come descritto in 1.6-1.7. Pellettare le celle mediante centrifugazione (5 min, 1.200 x g). Rimuovere il surnatante. Regolare la concentrazione a 0,5 milioni di cellule per ml mediante l'aggiunta di terreni EGM-2 MV completi preriscaldati.
4. Trasferire le aliquote delle celle nelle apposite piastre o palloni rivestiti di FN per la manutenzione. Agitare delicatamente e riporre nell'incubatrice. Sostituire il supporto entro 6-12 ore dalla placcatura. I supporti devono essere cambiati ogni 48 ore circa.

4. Trasfezione di cellule endoteliali

NOTA: Le cellule endoteliali primarie sono refrattarie alla trasfezione con i più comuni metodi chimici ed elettroporazione. Il metodo basato sulla trasfezione nucleare descritto di seguito consente un'efficienza di trasfezione relativamente elevata (~50-70%). Un metodo alternativo efficace è l'uso dell'infezione da parte di vettori virali appropriati (vedi commenti nella tabella dei materiali).

1. Preparare i matracci T25 o T75 (a seconda delle necessità) di HLMVEC o HDMVEC fino a una densità finale del 90-95% di confluenza. Rivestire con fibronectina (FN) 20ug/ml in PBS in condizioni sterili, piastre di coltura per microscopio come piastre Delta-T (per la fase 5) o vetrini coprioggetti circolari da 12 mm posizionati all'interno di un pozzetto di una piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti (per la fase 6) con come descritto sopra (2.1).
2. Aggiungere 1 ml di terreno di coltura EGM-2 completo alle piastre di coltura del microscopio o 0,5 ml a ciascun 24 pozzetti ed equilibrare le piastre in un incubatore umidificato a 37 °C/5% CO₂
.
3. Raccogliere e contare le cellule endoteliali come nei passaggi 3.1-3.3. Centrifugare il volume richiesto di cellule (0,5 milioni di cellule per campione) a 1.200 x g per 5 minuti a RT. Risospendere accuratamente il pellet di cellule in una soluzione di trasfezione nucleare RT da 100 μl per campione.
4. Combinare 100 μl di sospensione cellulare con 1-5 μg di DNA. Trasferire la sospensione cellulare/DNA in una cuvetta certificata; Il campione deve coprire il fondo della cuvetta senza bolle d'aria.
   NOTA: I costrutti che hanno come bersaglio YFP o DsRed sulla membrana cellulare (attraverso i 20 amminoacidi N-terminali della neuromodulina che contiene un segnale per la palmitoilazione post-traduzionale) sono stati utilizzati da soli (membrana-YFP da soli o membrana-DsRed da soli) o co-trasfettati con un marcatore volumetrico citoplasmatico (ad esempio, membrana-YFP e DsRed solubile). Possono essere utilizzate molte permutazioni di marcatori proteici fluorescenti.
5. Chiudere la cuvetta con il tappo. Inserire la cuvetta con la sospensione di cellule/DNA nel supporto della cuvetta dell'elettroporatore e applicare il programma di elettroporazione S-005. Estrarre la cuvetta dal supporto una volta terminato il programma.
6. Aggiungere ~500 μl di terreno di coltura pre-bilanciato alla cuvetta e rimuovere delicatamente la sospensione cellulare dalla cuvetta utilizzando le pipette di trasferimento in plastica fornite nel kit di trasfezione nucleare.
7. Per gli esperimenti con un microscopio, le piastre di coltura suddividono equamente la sospensione cellulare di una reazione tra due piastre contenenti terreni preriscaldati (Fasi 4.2-4.3). Per gli esperimenti che utilizzano 24 pozzetti/piastre, suddividere equamente una reazione tra 3 pozzetti.
8. Incubare le cellule in un incubatore umidificato a 37 °C/5% di CO₂ e cambiare il terreno 4-6 ore e di nuovo a 12-16 ore dopo la trasfezione.

5. Imaging e analisi di cellule vive

1. Preparazione dell'endotelio
   1. Giorno 0: Co-trasfettare gli HLMVEC primari con YFP di membrana e DsRed solubile tramite una tecnologia di nucleofessione come descritto nella fase 4 e piastra su piastre di coltura per imaging di cellule vive.
   2. Giorno 1: Sostituire il terreno con un terreno fresco contenente IFN-γ (100 ng/ml) per indurre l'espressione di MHC-II. Il giorno 2. Stimolare le cellule trasfettate mediante l'aggiunta di 20 ng/ml di TNF-α al terreno esistente.
   3. Il giorno 3, incubare l'endotelio con 1 μg/ml ciascuno dei superantigeni batterici stafilococco enterotossina B (SEB) e tossina 1 della sindrome da shock tossico (TSST) a 37 °C per 30-60 minuti immediatamente prima degli esperimenti. Omettere questo passaggio per le condizioni di controllo '-Ag'.
2. Preparazione dei linfociti
   1. Parallelamente al passaggio 5.1.3, preparare il tampone A (HBSS privo di rosso fenolo) integrato con 20 mM di HEPES, pH 7,4 e albumina sierica umana allo 0,5% v/v preriscaldata a 37 °C. Prelevare un campione di linfociti in coltura e determinare la densità contando con un emocitometro (Passaggio 1.12-1.17).
   2. Centrifugare 2 milioni di cellule per campione a 1.200 x g per 5 minuti a RT in una provetta conica da 15 ml. Aspirare il terreno e risospendere delicatamente il pellet cellulare in 2 ml di tampone A in modo che non rimangano grappoli di cellule.
   3. Rimuovere una nuova aliquota di colorante di calcio Fura-2 e risospendere in DMSO per ottenere una concentrazione madre di 1 mM.
   4. Aggiungere 2 μl di soluzione madre di Fura-2 alla sospensione di cellule T (concentrazione finale di 2 μM), tappare la provetta e mescolare immediatamente capovolgendo la provetta per garantire una dispersione uniforme del colorante. Incubare a 37 °C per 30 min.
   5. Centrifugare come al punto 5.2.2. Aspirare il Buffer-A e risospendere delicatamente ma accuratamente i linfociti in 20-40 μl di Buffer-A fresco.
3. Impostazione e acquisizione dell'imaging su cellule vive
   NOTA: Un'ampia varietà di sistemi può essere impiegata per l'imaging a fluorescenza di cellule vive su microscopi a luce verticale e invertita. I requisiti di base includono una sorgente di luce a fluorescenza e filtri, una telecamera CCD, commutazione motorizzata del filtro e otturatori, un tavolino riscaldato (o una camera riscaldata montabile al microscopio) e un software per l'acquisizione automatizzata delle immagini. Per questo protocollo, sono necessarie lenti ad immersione in olio ad alta apertura numerica e ad alto ingrandimento (ad esempio, 40X, 63X) per ottenere la risoluzione spaziale necessaria. Particolare attenzione deve essere prestata nella scelta della sorgente di fluorescenza e delle lenti appropriate per l'imaging del calcio basato su Fura-2, poiché non tutte sono compatibili con le lunghezze d'onda di eccitazione di 340/380 nm richieste. Un approccio alternativo (compatibile con i set di filtri a fluorescenza standard verdi e rossi) può essere utilizzato con coloranti sensibili al calcio non raziometrici (ad esempio, Fluo-4, Rhod-3), sebbene questi non siano in grado di quantificare con precisione il flusso di calcio e forniscano solo una lettura relativa/quantitativa.
   1. Accendere il sistema del microscopio (PC per il funzionamento, microscopio, telecamera CCD, ruota portafiltri e lampada allo xeno).
   2. Apri il software designato.
   3. Impostazione del microscopio/software per l'imaging time-lapse multicanale automatizzato. Include l'acquisizione sequenziale di un contrasto interferenziale differenziale (DIC), fluorescenza verde standard, fluorescenza rossa standard e immagini Fura-2 di eccitazione standard a 340 e 380 nm. Impostare l'intervallo per l'acquisizione su 10-30 secondi e una durata totale di ~20-60 minuti.
      1. Impostare i tempi di esposizione per l'imaging Fura-2.
         1. Aggiungere olio nuovo per l'obiettivo e montare una capsula per microscopio contenente solo 0,5 ml di Buffer-A sull'adattatore del tavolino di riscaldamento e accendere immediatamente per equilibrare a 37 °C (ci vorranno ~2-3 minuti).
         2. Aggiungere i linfociti caricati con Fura2 a riposo nella camera del microscopio montata utilizzando una pipetta da 20 μl.
         3. Attiva l'imaging in campo chiaro. Selezionare il percorso della luce verso gli oculari. Utilizzare la manopola di messa a fuoco grossolana per portare l'obiettivo a contatto con il fondo del piatto del microscopio. Utilizzare l'oculare e la manopola di messa a fuoco fine per mettere a fuoco le cellule T depositate sul fondo del piatto.
         4. Utilizzare i controlli dello stage x-y per selezionare un campo contenente almeno 10 celle. Evita i campi sovraffollati e i grumi di cellule in quanto creerebbero artefatti di imaging.
         5. Passa da un campo luminoso a una sorgente luminosa fluorescente. Passa dall'imaging dell'oculare alla fotocamera CCD. Impostare i parametri di acquisizione (ad esempio, tempo di esposizione, guadagno del rivelatore e binning). Utilizzando il software acquisisci immagini a riposo Fura2-340 e Fura2-380 (a partire da un tempo di esposizione identico per ciascuna, solitamente nell'intervallo ~200-1.000 msec).
         6. Utilizzare i metodi descritti al punto 5.4.1 per calcolare il Fura2-340/Fura2-380 per ciascun linfocita. Eseguire iterazioni ripetute per regolare i tempi di esposizione di Fura2-340 e Fura2-380, acquisire immagini e calcolare i rapporti fino a quando i valori medi non sono vicini a 1.
      2. Imposta i tempi di esposizione per mem-YFP e DsRed.
         1. Sostituire la capsula del microscopio utilizzata nella fase 5.3.3.1 con una capsula del microscopio contenente HLMVEC o HDMVEC trasfettati, attivati e trattati con SAg (o non trattati; controllo) provenienti dall'incubatore per colture cellulari (fasi 4.5.1). Utilizzare una pipetta di trasferimento monouso per rimuovere rapidamente il terreno, sciacquare una volta l'aggiunta di ~1 ml di Buffer-A preriscaldato. Aspirare e poi aggiungere 0,5 ml di Buffer-A.
         2. Identificare i campi in cui sono presenti cellule endoteliali transfettanti positive fluorescenti luminose e appaiono sane con giunzioni intercellulari ben formate.
         3. Regola i parametri di acquisizione (ad esempio, tempo di esposizione, guadagno del rivelatore e binning) per mem-YFP e DsRed. Assicurarsi che l'intensità media del segnale di fluorescenza in ciascun canale sia compresa tra il 25% e il 75% della gamma dinamica del rivelatore.
4. Condurre esperimenti di imaging su cellule vive.
   1. Utilizza il software automatizzato per avviare l'acquisizione delle immagini e acquisire diversi intervalli di immagini per stabilire una linea di base.
   2. Durante l'acquisizione, applicare ~5 μl di linfociti concentrati caricati con Fura-2 (dal passaggio 5.2) al centro del campo di imaging del piatto del microscopio inserendo la punta di una pipetta di piccolo volume (P-5 o P-20) nel terreno vicino al centro dell'obiettivo ed espellendo lentamente.
   3. Quando i linfociti si depositano nel campo di imaging, effettuare regolazioni fini nella messa a fuoco per garantire che l'interfaccia cellula T-cellula endoteliale (sinapsi immunologiche) sia mantenuta sul piano focale. Con obiettivi 40 e 63X, ~10-20 celle per campo sono ottimali. Se si osservano meno cellule nel campo di imaging, ripetere il passaggio 5.3.4.2.
   4. Dopo aver completato l'intervallo di osservazione desiderato dell'esperimento, continuare l'imaging e pipettare immediatamente la ionomicina direttamente nel piatto del microscopio (utilizzando la tecnica come in 5.3.4.2) a una concentrazione finale di 2 μM per indurre il massimo flusso di calcio/segnale di segnalazione Fura-2 (cioè un mezzo di calibrazione, vedere analisi 5.4.).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
BD Vacutainer laccio emostatico elasticizzato senza lattice	BD Bioscienze	367203
Tamponi imbevuti di alcol BD	BD Bioscienze	326895
BD Vacutainer Safety-Lok	BD Bioscienze	367861	K2 EDTA
BD Vacutainer Set per la raccolta del sangue a pulsante	BD Bioscienze	367335
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R8758-1L
Ficoll-Paque	Sigma-Aldrich	GE17-1440-02	Portare a RT prima dell'uso
FCS-Optima	Atlanta Biologici	S12450	Calore inattivato
Penicillina-Streptomicina	Sigma-Aldrich	P4458-100ML
Tripan blu	Sigma-Aldrich	T8154-20ML
Enterotossina B stafilococcica	Tecnologia delle tossine	BT202RED	Soluzione madre 1 mg/ml in PBS
Sindrome da shock tossico tossina 1	Tecnologia delle tossine	TT606RED	Soluzione madre 1 mg/ml in PBS
IL-15 umana	Sistemi di ricerca e sviluppo	247-IL-025	Soluzione madre 50ug/ml in PBS
Pbs	Tecnologie per la vita	Codice 10010-049
Fibronectina	Tecnologie per la vita	Codice 33016-015	Soluzione madre 1 mg/ml in H20
HMVEC-d Cellule endodontometriche MV addermiche	Lonza	CC-2543	Possono essere utilizzate altre EC microvascolari umane, ad esempio HLMVEC
Kit proiettili EGM-2 MV	Lonza	CC-3202
Tripsina-EDTA	Sigma-Aldrich	T-4174	Soluzione madre 10x, diluita in PBS
Kit nucleolettore Amaxa-HMVEC-L	Lonza	VPB1003	Kit necessario per il passaggio 4
Filtri IFN-g	Sigma-Aldrich	I3265	Soluzione madre 1 mg/ml in H20
TNF-alfa 10ug, umano	Tecnologie per la vita	PHC3015	Soluzione madre 1 mg/ml in H20
HBSS senza rosso fenolo	Tecnologie per la vita	Codice 14175-103
Hepes	Fisher Scientifico	BP299-100
cloruro di calcio	Sigma-Aldrich	C1016-100G	Soluzione madre 1M in H20
cloruro di magnesio	Sigma-Aldrich	208337	Soluzione madre 1M in H20
Albumina sierica umana	Sigma-Aldrich	A6909-10ml
Immersol 518 F Olio da immersione senza fluorescenza	Fisher Scientifico	12-624-66A
Fura-2 AM 20x50ug	Tecnologie per la vita	F1221	Soluzione madre 1mM in DMSO
pEYFP-Mem (Mem-YFP)	Clontech	Codice 6917-1
pDsRed-monomero (DsRed citoplasmatico solubile)	Clontech	632466
Membrana monomerica pDsRed (Mem-DsRed)	Clontech	632512
pEGFP-Actina	Clontech	Codice 6116-1
Alexa Fluor 488 Falloidina	Tecnologie per la vita	Codice A12379
Provette da centrifuga coniche Falcon 15mL	Fisher Scientifico	14-959-70C
Provette da centrifuga coniche Falcon 50mL	Fisher Scientifico	14-959-49A
Fiasche trattate con coltura tissutale Falcon T25	Fisher Scientifico	10-126-9
Fiasche trattate per coltura tissutale Falcon T75	Fisher Scientifico	13-680-65
Coltura cellulare Corning trattata T175	Fisher Scientifico	10-126-61
Vetrini coprioggetti	Fisher Scientifico	12-545-85	Diametro 12 mm
Piastre per colture tissutali Falcon a 24 pozzetti	Fisher Scientifico	08-772-1
Piastre Delta-T	Bioptech	Codice 04200415B
Pipette Pasteur usa e getta Wheaton	Fisher Scientifico	13-678-8D
Tubo Eppendorf da 1,5 ml	Fisher Scientifico	05-402-25
ICAM1 topo anti-umano	BD Bioscienze	555509
HS1 topo anti-umano	BD Bioscienze	610541
Purificato anti-umano CD11a (LFA-1alpha)	ebioscience	BMS102
Anti-umano CD3 Alexa Fluor® 488	ebioscience	53-0037-41
Anticorpo anti-MHC di classe II	Abcam	AB55152
Anticorpo anti-Talin 1	Abcam	ab71333
Anticorpo theta anti-PKC	Abcam	ab109481
Fosfotirosina (4G10 Platino)	Millipore	50-171-463
Nucleofector II	Amaxa Biosystems		Elettroporatore necessario per la fase 4
Zeiss Axiovert	Carl Zeiss MicroImaging
Zeiss LSM510	Carl Zeiss MicroImaging
Zeiss Axiovison Software	Carl Zeiss MicroImaging
Cabina di sicurezza biologica NU-425 (serie 60)	NuAIRE	Nu-425-600
Forma STRCYCLE 37 °C, 5% CO2 Incubatore per colture cellulari	Fisher Scientifico	Codice 202370
Centrifuga 5810	Eppendorf	EW-02570-02
Emocitometro	Sigma-Aldrich	Z359629	Emocitometro a linea luminosa
Isotemp Bagnomaria modello 202	Fisher Scientifico	Codice 15-462-2