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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Modello murino transgenico dello sviluppo del cancro al seno
- Osservare i topi dal modello di cancro desiderato per la crescita tumorale appropriata tramite palpazione o misurazione del calibro prima di procedere.
nota: In questo caso, è stato utilizzato il modello murino transgenico di sviluppo del cancro al seno (FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J) (MMTV-PyMT). Questi animali sviluppano spontaneamente carcinomi mammari invasivi tra le 6 e le 12 settimane di età in ciascuna ghiandola mammaria. Le ghiandole mammarie normali sono state utilizzate come controlli dai compagni di cucciolata transgene-negativi e di pari età.
2. Iniezione endovenosa di agenti anticorpali specifici e non specifici
- Purificare gli anticorpi di controllo dell'isotipo B7-H3 anti-topo di coniglio e dell'immunoglobulina G (IgG) di coniglio su una colonna di desalinizzazione (ad es. PD-10) per rimuovere i conservanti e i tamponi di conservazione seguendo le istruzioni del produttore.
nota: Alcuni anticorpi potrebbero richiedere un'ulteriore purificazione con il protocollo basato su perle di agarosio di proteina-A.
- Dosaggi aliquote di 33 μg di ciascun coniugato anticorpale in provette individuali per microcentrifuga.
nota: Il dosaggio dell'agente somministrato può variare a seconda dell'applicazione e corrisponde ai dosaggi a cui viene utilizzato abitualmente il coniugato anticorpale. La concentrazione delle soluzioni anticorpali è necessaria se il volume è superiore a 100 μl per la sicurezza degli animali.
- Al momento desiderato prima del prelievo dei tessuti, qui 96 ore, anestetizzare l'animale portatore di tumore con isoflurano al 2% che scorre nell'ossigeno a 2 L/min e posizionarlo su un tavolino riscaldato a 37 °C. Fai un pizzico sulle dita dei piedi per assicurarti che sia stato raggiunto il livello corretto di anestesia prima della procedura.
- Per prepararsi all'inoculazione delle soluzioni anticorpali nella vena caudale, disinfettare la coda dell'animale strofinandola tre volte con una salvietta imbevuta di alcol. Dilatare le vene della coda riscaldandole con un termoforo per circa 30 secondi. Evitare di riscaldare l'intero animale. Pulisci ancora una volta la coda con una salvietta imbevuta di alcol dopo aver rimosso il termoforo.
- Utilizzando un catetere per vena caudale 27G, inserire l'ago a farfalla in una delle due vene laterali della coda e fissare con cura la coda con l'ago inserito al tavolino con un pezzo di nastro chirurgico.
nota: Il riflusso visibile del sangue nel catetere indica la posizione corretta dell'ago all'interno della vena caudale.
- Lavare il catetere con 25 μL di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS), quindi iniettare la soluzione anticorpale nel catetere utilizzando siringhe da insulina. Lavare nuovamente il catetere con 25 μl di PBS sterile.
- Rimuovere l'ago dalla coda e applicare pressione per fermare l'emorragia.
- Spegnere l'anestesia e osservare l'animale fino a quando non si sveglia completamente per eventuali segni di angoscia.
3. Raccolta e preparazione dei tessuti tumorali bersaglio
- Al momento desiderato, sopprimere umanamente l'animale secondo la procedura istituzionale accettabile, qui, mediante inalazione graduale del 100% di CO2 da un serbatoio di gas compresso con una portata di spostamento della camera del 10-30% in volume / min.
nota: Alcune applicazioni della tecnica IVIL richiedono l'eutanasia mediante perfusione cardiaca con PBS per rimuovere gli anticorpi liberamente circolanti.
- Dopo la conferma dell'eutanasia umana attraverso la cessazione del movimento respiratorio e cardiaco, la mancanza di risposta al pizzicamento delle dita dei piedi e l'ingrigimento delle mucose, asportare i tessuti tumorali utilizzando forbici e pinze chirurgiche come segue:
- Stendere il topo in posizione supina e afferrare con una pinza solo lo strato esterno di pelle tra l'insieme delle ghiandole mammarie più vicine alla coda (5a), praticare una piccola incisione con un paio di forbici chirurgiche.
- Introdurre le forbici chiuse nel taglio e aprire lentamente la punta per separare accuratamente la pelle dalla sottostante membrana della parete addominale mantenendola intatta.
- Praticare un'incisione verticale lungo l'addome, continuando a separare la pelle dalla membrana interna. Tra la 3a e la 4a ghiandola mammaria, fare un taglio orizzontale attraverso l'addome per consentire la retrazione della pelle e la visualizzazione delle ghiandole mammarie><.
nota: I tumori mammari e le ghiandole si trovano superficialmente sotto la pelle.
- Afferrando ogni tumore o ghiandola normale con una pinza, tagliare accuratamente la pelle attaccata usando le forbici chirurgiche.
- Posizionare i fazzoletti asportati in stampi di base monouso, preetichettati e riempiti con mezzo di inclusione a temperatura di taglio ottimale (OCT), e congelare rapidamente gli stampi posizionandoli su ghiaccio secco. Al fine di studiare la somministrazione fuori bersaglio, asportare altri tessuti o organi di interesse (ad esempio, il fegato o i polmoni).
nota: Per mettere in pausa il protocollo a questo punto, conservare i blocchi di tessuto congelati a -80 °C fino al momento di procedere.
- Utilizzando un criostato, sezionare blocchi di tessuto congelato a uno spessore di 10 μm e posizionare le sezioni adiacenti su vetrini di adesione premarcati.
nota: Per mettere in pausa il protocollo a questo punto, conservare i vetrini a -80 °C fino al momento di procedere.
4. Protocollo di colorazione ex vivo
NOTA: Per il confronto quantitativo tra le immagini di microscopia a fluorescenza, tutti i vetrini vengono colorati contemporaneamente con le stesse soluzioni preparate.
- Sciacquare i vetrini di tessuto congelati con PBS a temperatura ambiente per 5 minuti per rimuovere l'OCT.
- Delimitare le sezioni di tessuto con una penna barriera idrofobica per ridurre il volume delle soluzioni necessarie durante la colorazione.
nota: Fare attenzione a non lasciare che la penna passi sui campioni di tessuto in quanto potrebbe rimuovere il tessuto dal vetrino o impedire una corretta colorazione sulla parte di tessuto interessata. Non lasciare che le sezioni di tessuto si disidratino in nessun punto.
- Fissare le sezioni di tessuto con una soluzione di paraformaldeide al 4% per 5 minuti.
- Risciacquare i vetrini in PBS per 5 min.
- Permeabilizzare le sezioni di tessuto con Triton-X 100 allo 0,5% in PBS per 15 minuti.
- Risciacquare i vetrini in PBS per 5 min.
- Bloccare i tessuti con albumina sierica bovina (BSA) al 3% p/v e siero di capra al 5% v/v, entrambi in PBS (soluzione bloccante) per 1 ora a temperatura ambiente.
nota: Abbinare il siero in soluzione bloccante all'animale ospite dell'anticorpo secondario.
- Risciacquare i vetrini in PBS per 5 min.
- Incubare le sezioni con anticorpi primari di registrazione come desiderato, possibilmente un comune marcatore nucleare (ad es. DAPI), vascolare (ad es. CD31) o citoplasmatico (ad es. actina). Qui, il CD31 (marcatore vascolare) anti-topo di ratto a una diluizione 1:100 è stato utilizzato secondo le istruzioni del produttore nella soluzione bloccante per una notte a 4 °C protetta dalla disidratazione su un vassoio di vetrini.
nota: Non aggiungere ulteriori anticorpi primari o anticorpi coniugati. Il coniugato che è stato iniettato e lasciato accumulare nei tessuti in vivo agisce come anticorpo primario.
- Sciacquare i vetrini in PBS per 5 minuti tre volte, cambiando ogni volta il PBS.
- Incubare i vetrini con anticorpi secondari per marcare gli anticorpi primari. Per questa applicazione, visualizzare l'anticorpo anti-B7-H3 utilizzando l'anticorpo anti-coniglio di capra coniugato AlexaFluor-546 (diluizione 1:200, ottimizzata secondo le istruzioni del produttore) e il CD31 con l'anticorpo secondario anti-ratto di capra AlexaFluor-488 (diluizione 1:200, ottimizzata secondo le istruzioni del produttore) in soluzione bloccante, protetto dalla luce e dalla disidratazione su un vassoio per vetrini, per 1 ora a temperatura ambiente.
nota: Gli anticorpi secondari provengono dallo stesso animale ospite, ma corrispondono all'affinità degli anticorpi secondari rispetto alla specie ospite del rispettivo anticorpo primario. Da questo punto in poi, i vetrini sono protetti dalla luce.
- Sciacquare i vetrini in PBS per 5 minuti tre volte, cambiando ogni volta il PBS.
- Applicare una goccia del mezzo di montaggio al centro della fetta di tessuto e posizionare con cura un vetrino coprioggetti evitando l'intrappolamento di bolle d'aria.
- Sigillare i bordi del vetrino coprioggetto con smalto trasparente e lasciare asciugare.
nota: Per mettere in pausa il protocollo per un massimo di una settimana a questo punto, conservare i vetrini a -20 °C fino al momento di procedere.
5. Imaging al microscopio confocale e analisi quantitativa delle immagini
NOTA: La preparazione del microscopio confocale e i parametri di imaging dipenderanno dal sistema confocale utilizzato. Il microscopio qui utilizzato è stato acquistato commercialmente (ad esempio, il sistema Zeiss LSM 510 Meta) ed è stato utilizzato il software di acquisizione associato (ad esempio, Zen 2009). Tuttavia, molti di questi passaggi si applicano a qualsiasi microscopio confocale e presuppongono una conoscenza di base della microscopia confocale.
- Dopo che il sistema è stato acceso e riscaldato, selezionare l'obiettivo desiderato; in questo caso è stato utilizzato un obiettivo 20x (apertura numerica = 0,8).
- Caricare un vetrino di controllo positivo, vetrino coprioggetti verso il basso, per consentire l'impostazione dell'ottimizzazione per il segnale più luminoso. Imaging nel canale rosso, mettere a fuoco il sistema sul campione in modalità Live imaging.
- Per ogni canale laser utilizzato, ottimizzare l'intensità del laser, il guadagno master e le dimensioni del foro stenopeico come segue:
- Passa alla modalità continua per l'imaging.
- Ottimizza le barre di scorrimento dell'intensità laser (che controlla la potenza del laser) e del guadagno (Master) (che controlla la tensione per il tubo fotomoltiplicatore) mentre monitori l'istogramma della tabella di ricerca (LUT). Regolate queste due impostazioni fino a riempire l'intervallo dinamico dell'istogramma senza saturare i pixel.
nota: Se l'intensità del laser è troppo alta, si verificherà il fotosbiancamento. Se il Guadagno (Master) è troppo alto, l'immagine diventerà rumorosa. Idealmente, il Guadagno (Master) sarà nel mezzo del suo intervallo.
- Imposta il foro stenopeico su 1 unità ariosa (AU), che offre la massima risoluzione e la z-slice più sottile.
- Far scorrere la barra di offset digitale per ridurre al minimo il rumore di fondo sull'istogramma LUT per ottenere uno sfondo nero reale.
nota: Una volta ottimizzate le impostazioni della microscopia per ciascun canale laser e obiettivo, mantenerle costanti durante la sessione di imaging e per l'imaging di tutti i vetrini, per consentire il confronto quantitativo tra i vetrini.
- Nella scheda Modalità di acquisizione, in Media, selezionare il numero e la profondità di bit desiderati. Fare clic sul pulsante Ottimale per impostare la dimensione ottimale in pixel.
- Utilizzare il pulsante di acquisizione Snap per raccogliere un'immagine di alta qualità. Qui, sono stati selezionati campi visivi casuali all'interno del tumore, ma altre aree di interesse possono essere applicate per diverse applicazioni (vasi, margini tumorali, profondità di penetrazione, ecc.)
- Salva i file di immagine nel formato utilizzato dal software confocale (qui, ".lsm") per l'elaborazione e la quantificazione offline.
nota: Se non tutte le diapositive vengono visualizzate durante la stessa sessione, salvare le impostazioni e ricaricarle nelle visite successive, anche se non è consigliabile ricreare l'immagine della stessa diapositiva a causa del fotosbiancamento.
- Eseguire le misurazioni quantitative dell'intensità della fluorescenza. Apri Fiji (Fiji è solo il software ImageJ) e carica un file immagine .lsm trascinandolo sulla barra di stato.
- Dividi i dati del canale colore. Vai a Immagini > Pile > Canali divisi.
- Pre-elabora le immagini a fluorescenza secondo necessità, ovvero sottrai il segnale di fondo (Elabora > Sottrai sfondo) o riduci il rumore tramite un metodo di filtraggio.
- Segmentare il canale di colore corrispondente alla proteina di riferimento (colorazione vascolare, nucleare, cellulare) impostando una soglia sull'intensità del segnale (Image > Adjust > Threshold).
nota: La soglia manuale introduce la soggettività nell'analisi delle immagini, pertanto, l'utilizzo di un algoritmo di soglia automatizzato o il riferimento agli istogrammi delle immagini rende i risultati dell'analisi delle immagini meno distorti.
- Utilizzare questa soglia per creare una maschera binaria (Elabora > Binario > Converti in maschera).
- Misurare ed etichettare le ROI all'interno della maschera (Analizza > Analizza particelle > selezionare Aggiungi a Manager > OK).
- Applicare le ROI al canale di colore corrispondente all'anticorpo di interesse (Fare clic sull'immagine del canale, Analizza > Strumenti > ROI Manager > Misura). In questo modo verranno applicate le ROI della maschera all'immagine dell'anticorpo e verranno fornite le misurazioni dell'immagine per le sezioni dell'etichetta nella finestra Risultati. Finestra Salva risultati (File > Salva).
- Calcola la statistica di interesse desiderata, come l'intensità media della fluorescenza come descritto qui.
- Esegui tutte le fasi di elaborazione in modo identico a ciascuna immagine all'interno di una serie di diapositive. Creare una macro per eseguire automaticamente questa operazione per batch di immagini di grandi dimensioni.
- Per la visualizzazione delle immagini solo dopo misurazioni quantitative, applicare regolazioni qualitative dell'immagine per ottimizzare la visualizzazione dei modelli di biodistribuzione regolando il minimo, il massimo, la luminosità e il contrasto agli stessi livelli su tutti i vetrini (> immagine Regola > luminosità/contrasto).
- Converti il tipo di immagine (Tipo di > immagine > Colore RGB) e salva i file in un tipo di immagine senza perdita di dati come .tiff (File > Salva con nome > Tiff...) per l'utilizzo in presentazioni e pubblicazioni.