Un test immunologico multiplex basato su microsfere per identificare gli anticorpi patogeno-specifici nella saliva

Abstract

Fonte: Augustine, S. A. J., et al. Sviluppo di un test immunologico multiplex di anticorpi salivari per misurare l'esposizione umana ai patogeni ambientali. J. Vis. Exp. (2016).

Questo video mostra una tecnica di immunodosaggio multiplex basata su perline per rilevare simultaneamente gli anticorpi per più agenti patogeni ambientali nella saliva umana. Le perle fluorescenti sono state accoppiate ad antigeni di diversi agenti patogeni, che sono stati catturati utilizzando anticorpi nel campione di saliva umana. Dopo aver marcato gli anticorpi utilizzando un reporter fluorescente, le perle sono state analizzate utilizzando la citometria a flusso per valutare la presenza di diversi anticorpi patogeno-specifici nella saliva.

Protocol

1. Accoppiamento del tallone

1. Accoppiare gli antigeni ai set di microsfere utilizzando le concentrazioni mostrate nella Tabella 1.
2. Aggiungere ciascun antigene alle microsfere attivate e portare il volume totale a 500 μl in 50 mM MES, pH 5.0. Mescolare gli antigeni e le perle a vortice.
3. Incubare gli antigeni e le perle per 2 ore mescolando a rotazione (~15 giri/min) a temperatura ambiente al buio. Pellettare le perle accoppiate mediante microcentrifugazione a 10.000 x g per 2 min.
4. Rimuovere il surnatante e risospendere le perle in 500 μl di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)-albumina sierica bovina (BSA)-poliossietilene sorbitano monolaurato (Tween-20)-azoturo di sodio (PBS-TBN) pH 7,4 mediante vortice e sonicazione. Pellettare le perle mediante microcentrifugazione a 10.000 x g per 2 minuti e rimuovere il surnatante.
   cautela: L'azoturo di sodio è una sostanza chimica estremamente tossica. È letale se ingerito o viene a contatto con la pelle. Non respirare polvere/fumi/gas/nebbia/vapori o spray. Indossare dispositivi di protezione individuale (DPI) adeguati durante la manipolazione e lo smaltimento in conformità con le leggi pertinenti.
5. Risospendere le perle in 1 ml di PBS-TBN a vortice e sonicazione per 20 sec.
6. Pellettare le perle mediante microcentrifugazione a 10.000 x g per 2 min.
7. Ripetere i passaggi 1.5 e 1.6.
   nota: In questo modo si ottengono un totale di due lavaggi con PBS-TBN.
8. Risospendere le perle accoppiate e lavate in 1 ml di PBS, 1% BSA, 0,05% Azide, pH 7,4. Conservare le perle accoppiate in frigorifero a 2-8 °C al buio.

2. Immunodosaggio Multiplex Salivare

1. Togliete la saliva dal congelatore a -80 °C e lasciatela scongelare a temperatura ambiente.
2. Risospendere le perle accoppiate all'antigene mediante vortice e sonicazione per 20 secondi.
3. Preparare una miscela di perle di lavoro diluendo le perle accoppiate fino a una concentrazione finale di 100 perle/μl di ogni singolo set di perle in tampone PBS-1% BSA.
4. Preparare una diluizione 1:4 della saliva con tampone PBS-1% BSA in una piastra profonda a 96 pozzetti.
5. Pre-bagnare la piastra filtrante con 100 μl di tampone di lavaggio e rimuovere il surnatante sottovuoto.
6. Aggiungere 50 μl di una miscela di perline di lavoro e un volume uguale di saliva diluita a 95 pozzetti delle piastre filtranti a 96 pozzetti per una diluizione finale 1:8. Mescola le reazioni con un pipettatore multicanale. A un pozzetto di controllo, aggiungere 50 μl di perle accoppiate all'antigene più 50 μl di tampone PBS-1% BSA (in sostituzione della saliva).
7. Coprire e lasciare incubare al buio a temperatura ambiente per 1 ora su un agitatore per micropiastre a 500 giri/min. Rimuovere il surnatante con l'aspirapolvere. Lavare i pozzetti con 100 μl di tampone di lavaggio e rimuovere il surnatante con il vuoto. Ripetere il lavaggio 1 volta.
8. Risospendere le microsfere in 50 μl di PBS-1% BSA con un pipettatore multicanale.
9. Diluire l'anticorpo di rilevamento secondario IgG umano di capra biotinilato a 16 μg/ml in PBS-1% BSA.
10. Aggiungere 50 μl di anticorpo secondario diluito a ciascun pozzetto e miscelare il contenuto con un pipettatore multicanale.
11. Coprire la piastra filtrante e lasciarla incubare al buio a temperatura ambiente per 30 minuti su uno shaker a piastre. Rimuovere il surnatante con l'aspirapolvere. Lavare i pozzetti con 100 μl di tampone di lavaggio e rimuovere il surnatante con il vuoto. Ripetere il lavaggio 1 volta.
12. Risospendere le microsfere in 50 μl di PBS-1% BSA con un pipettatore multicanale.
13. Diluire il reporter streptavidina-R-ficoeritrina (SAPE) a 24 μg/ml in PBS-1% BSA.
14. Aggiungere 50 μl di reporter a ciascun pozzetto e miscelare con un pipettatore multicanale.
15. Coprire la piastra filtrante e lasciarla incubare al buio a temperatura ambiente per 30 minuti su uno shaker a piastre. Rimuovere il surnatante con l'aspirapolvere. Lavare i pozzetti con 100 μl di tampone di lavaggio e rimuovere il surnatante con il vuoto. Ripetere il lavaggio 1 volta.
16. Risospendere le microsfere in 100 μl di PBS-1% BSA e analizzare 50 μl utilizzando l'analizzatore.
    nota: I risultati del test immunologico multiplex sono misurati in unità di intensità di fluorescenza mediana (MFI). Fare sempre riferimento all'ultima versione del manuale del software, se disponibile per evitare errori.

Tabella 1: Miscela di perline di lavoro per il test immunologico multiplex.Dopo che l'accoppiamento e la conferma sono stati completati, è stata preparata una miscela master composta da ciascun set di perline come mostrato. La miscela master è stata distribuita tra tutti i pozzetti nella piastra a 96 pozzetti. Tutti i pozzetti sono stati incubati con saliva ad eccezione di un pozzetto di controllo di fondo che conteneva solo perle e tampone BSA PBS-1%.

antigene	Set di perline	Buffer di accoppiamento	Concentrazione di Ag (μg)	# di perline in 1 angolo	# di perline/μl	Vol. per 100 B/uL per 4 ml (μl)
C. jejuni	8	MES 5.0	50	64	6.400	94
H. pylori	33	MES 5.0	25	71	7.100	85
Epatite A	42	MES 5.0	100	91	9.100	66
T. gondii	30	MES 5.0	25	85	8.500	71
Norovirus GII.4	55	MES 5.0	5	72	7.200	83
Norovirus GI.1	67	MES 5.0	5	63	6.300	95
Disaccoppiato	80	MES 5.0		60	6.000	100
		Volume totale delle perle (μl)				594
		Volume totale di tampone necessario (μl)				3.406

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Attrezzature e software
Microcentrifuga	Società Thermo Electron	75002446	Utilizzato per centrifugare i campioni
Miscelatore a vortice	VWR	G560	Utilizzato per miscelare i campioni
Sonicatore (mini)	Fisher Scientifico	15-337-22	Utilizzato per separare le perline
Pipettatori P10, P20, P100, P1000, 8 cat.	Capp	diverso
Collettore per vuoto multischermo	Millipore	MSVMHTS00	Utilizzato nelle fasi di lavaggio per rimuovere il surnatante
Microagitatore	VWR	Codice 12620-926	Utilizzato per agitare le perle durante l'incubazione
Rack per provette (1,5 ml e 0,5 ml) (assortiti)	VWR	Codice 30128-346
bilancia	Mettler o altro		Utilizzato per misurare i reagenti di lavaggio per la produzione di tamponi
Dynabead Miscelatore di campioni	Invitrogen	947-01	Utilizzato durante la fase di incubazione dell'accoppiamento
MatLab (R2014b)	La MathWorks, Inc.		Utilizzato per analizzare i dati di risposta anticorpale
Microsoft Excel 2014	Società Microsoft		Utilizzato per analizzare i dati di risposta anticorpale
Analizzatore Luminex con software xPonent 3.1	Società Luminex	LX200-XPON3.1	Strumento e software utilizzati per eseguire il test
antigeni
GI.1 Virus Norwalk : particella p	Xi Jiang (CCHMC)*	Na	*Ospedale pediatrico di Cincinnati. Conc. finale 5 μg.
GII.4 Norovirus VA387 : p-particella	Xi Jiang (CCHMC)*	Na	*Ospedale pediatrico di Cincinnati. Conc. finale 5 μg.
Virus dell'epatite A : concentrato di grado II da coltura cellulare	Meridian Scienze della Vita	8505	Antigene accoppiato a 100 μg
Helicobacter pylori : lisato	Meridian Scienze della Vita	R14101	Antigene accoppiato a 25 μg
Toxoplasma gondii : p30 ricombinante (SAG1)	Meridian Scienze della Vita	Codice: R18426	Antigene accoppiato a 25 μg
Campylobacter jejuni : cellule intere uccise dal calore	KPL	50-92-93	Antigene accoppiato a 50 μg
Anticorpi primari
Porcellino d'India anti-Norovirus	(CCHMC)*	Na	Utilizzato per la conferma dell'accoppiamento
Topo anti-epatite A IgG	Meridian Scienze della Vita	C65885M	Utilizzato per la conferma dell'accoppiamento
Topo anti-epatite A IgG	Meridian Scienze della Vita	C65885M	Utilizzato per la conferma dell'accoppiamento
BacTraceAffinity Anticorpo purificato contro Helicobacter pylori	KPL	01-93-94	Utilizzato per la conferma dell'accoppiamento
Corpi di capra in Toxoplasma gondii	Abcam	Codice ab23507	Utilizzato per la conferma dell'accoppiamento
Specie BacTrace Goat anti-Campylobacter	KPL	01-92-93	Utilizzato per la conferma dell'accoppiamento
Anticorpi secondari
Biotina-SP-AffiniPuro Asino Anti-Capra IgG (H+L)	Jackson	705-065-149	Utilizzato per la conferma dell'accoppiamento
IgG biotinilate di coniglio anti-capra (H+L)	KPL	16-13-06	Utilizzato per la conferma dell'accoppiamento
IgG biotinilate di capra anti-topo (H+L)	KPL	16-18-06	Utilizzato per la conferma dell'accoppiamento
Affinità Anticorpo purificato Biotina marcato capra anti-coniglio IgG (H + L)	KPL	176-1506	Utilizzato per la conferma dell'accoppiamento
Affinità Anticorpo purificato Biotina marcato capra anti-Human IgG (γ)	KPL	16-10-02	Utilizzato per il dosaggio immunologico salivare
Consumo
Provette per microcentrifuga in copolimero da 1,5 mL	Stati Uniti d'America Scientific	1415-2500	Utilizzate come provette per microcentrifuga a basso legame
Ricariche per puntali per pipette da 10 μl	BioVentures	Codice: 5030050C
Ricariche per puntali per pipette da 200 μl	BioVentures	Codice: 5030080C
Ricariche per puntali per pipette da 1000 μl	BioVentures	Codice: 5130140C
Alluminio	Fornitori vari		Utilizzato per mantenere le perle al buio durante le incubazioni
Piastre per pozzetti profondi	VWR	40002-009	Utilizzato per diluire campioni di saliva
Piastre filtranti multischermo	Millipore	MABVN1250	Utilizzato per eseguire saggi
Sistema di raccolta saliva Oracol	Malvern Medical Developments Limited		Utilizzato per la raccolta della saliva
Reagenti
Microsfere carbossilate (perline)	Società Luminex	A seconda del set di perline	Gli antigeni sono accoppiati alle microsfere
EDC (cloridrato di 1-etil-3-[3dimetilamminopropil] carbodiimmide)	perforare	77149 o 22980	Utilizzato nell'attivazione del cordone
Sulfo-NHS (N-idrossisulfosuccinimide)	perforare	Codice 24510	Utilizzato nell'attivazione del cordone
Steptavidina-R-ficoeritrina (1mg/mL)	Sonde molecolari	S-866	Utilizzato come reporter
MES (acido 2-[N-morfolino]etansolfonico)	sigma	M-2933	Utilizzato per l'accoppiamento
Tween-20 (Monolaurato di poliossietilenesorbitano)	sigma	P-9416	Utilizzato nel tampone di lavaggio per rimuovere i legami non specifici
Tamponi proteici
Tampone di blocco/archiviazione PBS-TBN (PBS, 0,1% BSA, 0,02% Tween-20, 0,05% azide, pH 7,4)**			Filtro Sterilizzare e conservare a 4°C
PBS, pH 7,4	sigma	P-3813	138 mM NaCl, 2,7 mM KCl
Bsa	sigma	A-7888	0,1% (p/v)
Interpolazione-20	sigma	P-9416	0,2% (v/v)
Aziduro di sodio (0,05% azide)**	sigma	S-8032	**Attenzione: l'azide di sodio è estremamente tossica. Evitare il contatto con la pelle e gli occhi. Indossare DPI adeguati. Smaltire secondo le leggi applicabili.
MES/ Tampone di accoppiamento (0,05 M MES, pH 5,0)
MES (acido 2-[N-morfolino]etansolfonico)	sigma	S-3139
5 N NaOH	pescatore	SS256-500
Tampone per test (PBS, 1% BSA, pH 7,4)			Filtro Sterilizzare e conservare a 4°C
PBS, 1% BSA, pH 7,4	sigma	P-3688	138 mM di NaCl, 2,7 mM di KCl, 1% BSA
Tampone di attivazione (0,1 m NaH2PO4, pH 6,2)			Filtro Sterilizzare e conservare a 4°C
NaH2PO4 (Fosfato di sodio, monobasico anidro)	sigma	S-3139	0,1 milioni di NaH2PO4
5 N NaOH	pescatore	SS256-500
Tampone di lavaggio (PBS, 0,05% Tween-20, pH 7,4)			Filtro Sterilizzare e conservare a 4°C
PBS, 0,05% Tween-20, pH 7,4	sigma	P-3563	138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 0,05% TWEEN