Misurazione citofluorimetrica quantitativa della fagocitosi delle spore fungine da parte dei fagociti umani

Abstract

Fonte: Hartung, S., et al., Misurazione della fagocitosi di Aspergillus fumigatus Conidia da parte di leucociti umani utilizzando la citometria a flusso. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video dimostra un metodo per quantificare la fagocitosi delle spore fungine patogene marcate con FITC da parte dei leucociti umani. Le spore fagocitate vengono distinte dalle spore aderenti alle cellule attraverso la controcolorazione, seguita dall'analisi citofluorimetrica.

Protocollo

Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

1. Saggio di fagocitosi

1. Incubare 2 x 10,⁶ leucociti e 4 x 10,⁶ conidi marcati con FITC (molteplicità di infezione = 2) in 1,5 mL di RPMI + 10% FCS in una piastra di coltura cellulare a 12 pozzetti. Come controlli, includere solo le celle (senza conidi) e le celle + conidi non marcati.
2. Mettere in un incubatore umidificato a CO₂ a 37 °C e incubare per il periodo di tempo desiderato (ad es. 0,5 ore, 2 ore o 4 ore).
3. Dopo l'incubazione, prelevare le cellule con un raschietto cellulare e inserirle in una provetta da 15 ml.
4. Centrifugare per 5 minuti a 300 x g a temperatura ambiente.
5. Raccogliere il surnatante per l'analisi delle citochine o scartarlo se non lo si desidera. Risospendere ciascun campione in 100 μl di PBS + 2 mM EDTA.

2. Colorazione degli anticorpi

1. Per ogni campione, preparare 100 μl di miscela di anticorpi, compreso l'anticorpo APC anti-FITC, secondo la Tabella 1.
2. Inserire un campione da 100 μl in un pozzetto di una piastra con fondo a V a 96 pozzetti. Aggiungere 150 μl di PBS + 2 mM EDTA per il lavaggio.
3. Per la compensazione del colore, posizionare 1 x 10⁶ celle per ogni colore in ulteriori pozzetti della piastra inferiore a V a 96 pozzetti. Includi un pozzetto di cellule che non viene colorato. Aggiungere 150 μl di PBS + 2 mM EDTA per il lavaggio.
4. Coprire la piastra con una pellicola adesiva.
5. Centrifugare per 5 minuti a 300 x g a temperatura ambiente. Rimuovere la pellicola.
6. Eliminare il surnatante capovolgendo rapidamente e con forza la piastra solo una volta sopra il lavandino o con un tovagliolo di carta usa e getta.
   NOTA: Non ripetere o battere la lastra su una carta fino a quando non si asciuga poiché ciò comporterebbe una massiccia perdita di cellule dalla piastra.
7. Risospendere le cellule nella miscela di anticorpi da 100 μl e miscelare bene mediante pipettaggio.
8. Per la compensazione del colore, risospendere le rispettive cellule in 100 μL di PBS + 2 mM EDTA e aggiungere un singolo anticorpo a ciascun pozzetto alla stessa quantità utilizzata nella miscela di anticorpi.
9. Coprire con una pellicola adesiva e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente al buio.
10. Rimuovere la pellicola. Aggiungere 150 μL di PBS + 2 mM EDTA a ciascun pozzetto per il lavaggio. Coprire con una pellicola adesiva.
11. Centrifugare per 5 minuti a 300 x g a temperatura ambiente. Rimuovere la pellicola. Scartare il surnatante capovolgendo rapidamente e con forza la piastra sopra il lavandino o un tovagliolo di carta usa e getta.
12. Risospendere in 200 μl di PBS + 2 mM EDTA e trasferire le celle da ciascun pozzetto a una provetta a fondo rotondo separata. Assicurarsi che non ci siano gruppi di celle nella sospensione. Altrimenti rimuovi i cluster.
    NOTA: Ogni grappolo abbastanza grande da essere visto dall'occhio è abbastanza grande da intasare potenzialmente il citometro.

3. Citometria a flusso

1. Avviare il citometro a flusso e lasciarlo riscaldare. Avviare il software di acquisizione.
2. Creare un nuovo esperimento e configurare ed etichettare gli esempi.
3. Impostazione dei parametri (FSC 250, SSC 250) e dei rivelatori per i fluorofori FITC, APC, BUV395, V500 e PerCP-Cy5.5.
4. Configurazione della compensazione
   1. Aprire l'impostazione della retribuzione.
   2. Indica i singoli colori.
   3. Utilizzando le celle di controllo non colorate o con colorazioni individuali, impostare le tensioni del rivelatore PMT in modo da includere tutti gli eventi all'interno della scala.
   4. Registrare almeno 10.000 eventi di ogni controllo.
   5. Utilizzare la configurazione di compensazione per calcolare lo spillover dei fluorofori e applicarlo alle impostazioni del citometro dell'esperimento.
5. Registrazione dei dati di esempio
   1. Visualizza FSC e SSC nel software di acquisizione e imposta un cancello attorno ai leucociti.
   2. Sulla base del gate dei leucociti, visualizzare il dot plot SSC/CD45 e il gate per le cellule CD45⁺ da separare dai conidi.
   3. Visualizza le cellule CD45⁺ in un grafico a punti CD14/CD66b e porta separatamente i monociti (CD14⁺) e i neutrofili (CD66b⁺).
   4. Visualizza i neutrofili in un grafico a punti anti-FITC/FITC.
   5. Utilizzando il campione con conidi non marcati, impostare i quadranti per i segnali anti-FITC e FITC, consentendo un massimo dell'1% di cellule nei rispettivi quadranti.
   6. Ripetere i passaggi 3.5.4 e 3.5.5 per la porta dei monociti.
   7. Registrare tutti i campioni con almeno 20.000 eventi nella porta dei leucociti.

Tabella 1: Miscela di anticorpi per citometria a flusso. Le quantità di ciascun reagente sono indicate in microlitri per campione (1 x 10,⁶ cellule) da analizzare.

Reagente	μl per campione
CD45 BUV395	1
CD14 V500	0,5
CD66b PerCP-Cy5.5	1.5
anti-FITC APC	0,5
PBS + 2 mM EDTA	97
totale	100

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Pellicola adesiva	marchio	701367
Piastra per colture cellulari, 12 pozzetti	Greiner Bio-one	Codice 665180
Citometro	BD Bioscienze		LSR Fortessa II, laser: 488 nm (blu), 405 nm (viola), 355 nm (UV) e 640 nm (rosso)
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)	Sigma Aldrich	ED3SS-500g	2 mM in PBS
Isotiocianato di fluoresceina (FITC)	Sigma Aldrich	F3651-100MG	0,1 mM in soluzione di Na2CO3 /PBS
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	ThermoFisher Scientifico	Codice 189012-014	Senza Calcio, senza Magnesio
RPMI 1640	ThermoFisher Scientifico	61870010	RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplemento
Software per l'acquisizione e l'analisi dei dati	BD Bioscienze
Piastra con fondo a V, 96 pozzetti	marchio	781601	Superficie non trattata
Formaldeide	Carl Roth	PO87.3	Istofisso