Un test di immunofluorescenza per caratterizzare e quantificare i granuli di stress dei mammiferi

Abstract

Fonte: Aulas, A. et al., Metodi per classificare i focolai citoplasmatici come granuli di stress nei mammiferi.J. Vis. Exp. (2017)

Questo video mostra un test per caratterizzare e quantificare i granuli di stress dei mammiferi, che consistono in mRNA, proteine leganti l'RNA (RBP) e varie altre proteine.

Protocollo

1. Preparazione delle cellule

1. Aggiungere vetrini coprioggetti autoclavati a 12 pozzetti di una piastra a 24 pozzetti, come indicato nella Figura 1A; questo può essere fatto utilizzando una pipetta Pasteur sterile collegata a un vuoto per raccogliere ogni vetrino coprioggetti. Picchiettare delicatamente il vetrino coprioggetti sul lato del pozzetto per rilasciare l'aspirazione, permettendo al vetrino coprioggetti di cadere nel pozzetto.
2. Piastra 1 x 10⁵ cellule di osteosarcoma U-2 OS (U2OS) per pozzetto a un volume finale di 500 μL di terreno. Spostare la piastra da un lato all'altro e su e giù più volte per assicurarsi che le celle siano distribuite uniformemente.
3. Premere delicatamente i vetrini coprioggetti verso il basso con una punta P1000 pulita per assicurarsi che il vetrino coprioggetti si trovi sul fondo del pozzetto e che non vi siano bolle sotto il vetrino.

2. Stressare le Cellule

1. Il giorno seguente, controllare visivamente la piastra per assicurarsi che le cellule siano uniformemente disperse e uniformemente confluenti sul vetrino coprioggetti, poiché le variazioni tra i campioni possono influire negativamente sulla riproducibilità dei risultati. Utilizzare un obiettivo 10X su un microscopio per colture tissutali invertito.
2. Preriscaldare il fluido a 37 °C. Evitare di applicare fluidi freddi o caldi alle celle, poiché causano rispettivamente shock da freddo o da calore.
3. Diluire i farmaci in mezzi preriscaldati. Per ogni diversa concentrazione di farmaco, preparare 2 pozzetti contenenti 500 μL di terreno. Preparare altri 500 μl per evitare perdite durante il pipettaggio. Aliquotare 4 provette, ciascuna contenente 1,5 mL.
   1. Per l'arsenito di sodio: a ciascun pozzetto contenente 500 μL, aggiungere 1,5 μL di arsenito di sodio 100 mM (concentrazione finale: 100 μM) o aggiungere 0,75 μL di arsenito di sodio 100 mM (concentrazione finale: 50 μM).
   2. Per la vinorelbina: a ciascun pozzetto contenente 500 μL, aggiungere 22,5 μL di vinorelbina 10 mM (concentrazione finale: 150 μM) o aggiungere 18,75 μL di vinorelbina 10 mM (concentrazione finale: 100 μM).
      nota: L'arsenito di sodio è un induttore di granuli di stress ben caratterizzato e comunemente usato ed è quindi classicamente usato come controllo positivo.
4. Rimuovere ed eliminare il materiale dai pozzetti B1 - 4 e C1 - 4. Aggiungere il terreno con i farmaci e attendere 60 minuti (Figura 1A).
   1. Aggiungere 500 μL di terreno con 100 μM di arsenito di sodio ai pozzetti B1 e B2. Aggiungere 500 μl di terreno con 50 μM di arsenito di sodio ai pozzetti B3 e B4.
   2. Aggiungere 500 μL di terreno con 150 μM di vinorelbina ai pozzetti C1 e C2. Aggiungere 500 μL di terreno con 125 μM di vinorelbina ai pozzetti C3 e C4.
5. 30 minuti prima della fissazione, trattare i pozzetti della colonna 2 con 5 μL di cicloesimide (1 mg/mL di stock) e i pozzetti della colonna 4 con 2 μL di puromicina (1,25 mg/mL di stock). Agitare delicatamente la piastra per mescolarla prima di rimetterla nell'incubatore a 37 °C.

3. Fissazione cellulare e immunofluorescenza

NOTA: Prima dell'esperimento, assicurarsi che il metanolo sia raffreddato a -20 °C. Preparare tamponi, tra cui soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), siero di cavallo normale (NHS) al 5% in PBS e paraformaldeide (PFA) al 4% in PBS.

1. Eliminare il terreno e lavare i pozzetti contenenti i vetrini coprioggetti con PBS. A seconda dei farmaci utilizzati, potrebbe essere importante scartare correttamente i farmaci contenenti i mezzi; Contattare l'ufficio locale per la sicurezza ambientale per istruzioni specifiche. Per un lavaggio efficiente, riempire un flacone da spremere con PBS, tagliare la punta in modo da consentire un flusso delicato piuttosto che un flusso stretto e utilizzare questo per aggiungere PBS a ciascun pozzetto dopo aver aspirato il PBS originale.
2. Fissare le celle utilizzando ~250 μL di PFA al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente, RT con leggera agitazione. Coprire completamente la parte superiore del vetrino coprioggetti con PFA; 250 μl dovrebbero essere sufficienti, ma in caso contrario, aggiungine altri. Evitare sempre di pipettare direttamente sui vetrini, poiché alcune cellule (o i trattamenti di stress delle cellule) possono alterare l'adesione e la forza del pipettaggio può rimuovere le cellule.
3. Rimuovere il PFA e gettarlo correttamente. Contattare l'ufficio locale per la sicurezza ambientale per i dettagli su come smaltire correttamente la paraformaldeide.
4. Aggiungere ~250 μL di metanolo (-20 °C) e incubare per 5 minuti a RT sotto un leggero dondolio; questo permeabilizza e appiattisce le cellule.
5. Rimuovere ed eliminare il metanolo e bloccare le cellule applicando ~250 μL di NHS al 5% per 1 ora a RT durante la notte, O/N, a 4 °C. Contattare l'ufficio locale per la sicurezza ambientale per i dettagli su come smaltire correttamente il metanolo.
6. Per gli anticorpi primari, diluire gli anticorpi al 5% NHS.
   nota: L'uso di più marcatori SG è la chiave per confermare se i granuli osservati sono SG in buona fede. Il numero di marcatori SG che possono essere utilizzati dipende dai filtri disponibili nel microscopio. Se sono disponibili set di filtri standard per il verde, il rosso e il rosso lontano, utilizzare G3BP1, eIF4G ed eIF3b con una diluizione di 1/250.
   1. Per questo esperimento (12 vetrini coprioggetti a 250 μL ciascuno-Totale: 3 mL di 5% NHS), aggiungere 12 μL di ciascuno dei seguenti: anti-G3BP1, anti-eIF3b e anti-eIF4G. Incubare gli anticorpi primari agitando delicatamente per almeno 1 ora a RT o O/N a 4 °C.
7. Lavare i pozzetti 3 volte con PBS e incubare ogni lavaggio per 5 minuti.
8. Per gli anticorpi secondari, diluire tutti gli anticorpi secondari (diluizione 1/250) e il colorante Hoechst (diluizione 1/1.000) in NHS al 5%.
   1. Per questo esperimento (12 vetrini coprioggetti a 250 μL ciascuno-Totale: 3 mL di 5% NHS), aggiungere 12 μL di ciascuno dei seguenti: Cy2-Mouse, Cy3-Rabbit e Cy5-Goat (una diluizione di 1/250 di ciascuno) e aggiungere 3 μL di colorante Hoechst.
   2. Incubare i vetrini coprioggetti con gli anticorpi secondari per 1 ora a RT. Durante questa e le fasi successive, proteggere i campioni dalla luce coprendo la piastra con una scatola o posizionando un foglio sopra la piastra di coltura tissutale.
9. Lavare i pozzetti tre volte con PBS per 5 minuti ciascuno.
10. Montare i vetrini coprioggetti su vetrini etichettati utilizzando un mezzo di montaggio. Riscaldare il mezzo di montaggio in un blocco termico a 37 °C per 10 minuti; Ciò riduce la viscosità e facilita la pipettatura. Con un puntale P200 tagliato, pipettare 25 μl di terreno di montaggio per vetrino su un vetrino di vetro; 4-8 vetrini coprioggetti possono stare su un vetrino, supponendo che il tavolino del microscopio lo consenta. Utilizzando una pinza fine, trasferire il vetrino coprioggetti dal pozzetto al vetrino, assicurandosi di posizionare il lato della cella rivolto verso il basso sul mezzo di montaggio. Utilizzando una punta P200 pulita, premere il vetrino coprioggetti verso il basso.
11. Una volta montati tutti i vetrini coprioggetti, utilizzare un panno da laboratorio piegato per pulire il mezzo di montaggio in eccesso premendo molto saldamente il tessuto da laboratorio sul vetrino. Utilizzare un flacone da spremere contenente H₂O per eliminare il mezzo di montaggio in eccesso, quindi ripetere la tamponatura con un panno da laboratorio piegato per rimuovere l'acqua.

Risultati

Figura 1: Diagrammi sperimentali. (A) Cellule del seme su vetrini coprioggetti precedentemente posti in una piastra a 24 pozzetti, come indicato. Trattare le file A e B per 60 minuti con SA o VRB utilizzando la concentrazione in μM come indicato. Dopo 60 minuti, aggiungere CHX (concentrazione finale: 20 μg/mL per la colonna 2) o puro (20 μg/mL di puromicina per la colonna 4) al terre...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
U-2 OS	ATCC	ATCC®HTB-96™	- comunemente scritto come "U2OS" - coltura a 37 °C sotto il 5% di CO2 in 10% FBS/DMEM
Modifica di Dulbecco del medium dell'aquila	Corning	10-013-CV	- abbreviato DMEM - contiene 4,5 g/L di glucosio, piruvato e rosso fenolo - integrato con il 10% di FBS, 10 mM di HEPES e penicillina/steptomicina - Preriscaldare la diluizione del farmaco o dei farmaci precedenti - Preriscaldare la precedente diluizione del/i farmaco/i
Siero fetale bovino	sigma	F2442-500ml	- abbreviato FBS - utilizzato per integrare i media
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientifico	Codice 15630-080	- utilizzato per integrare i media
Penicillina streptomicina	sigma	P0781-100 ml	- utilizzato per integrare i media
Piastra a 24 pozzetti	Costar	Telefono 3524
Tessuti da laboratorio	SCIENZA KIMTECH	Telefono 34120	- comunemente chiamati "kimwipes"
Coverglass per occhiali di copertura per la crescita	Fisher Scientifico	12-545-82	- autoclavato prima dell'uso - Mantenere sterile nella cappa di coltura tissutale
(meta)arsenito di sodio ≥90%	sigma	S7400-100G	- comunemente chiamato arsenito di sodio e abbreviato SA - dissoluzione in acqua a una concentrazione di 1 M, quindi diluita a 100 μM come materiale di lavoro
Vinorelbina	TSZ CHEM	RS055	- abbreviato VRB - sciogliere in acqua fino a 10 mM
Puromicina	sigma	P9620	- utilizzato per valutare il livello di traduzione (ribopuromylation) - utilizzato per valutare la connessione SG con traduzione attiva - diluire in acqua a 10 mg/mL
Emetina dicloridrato idrato	sigma	E 2375	- utilizzato in combinazione con puro per valutare il livello generale di traduzione - utilizzato per valutare la connessione SG con traduzione attiva - diluire in acqua a 10 mg/mL
cicloesimide	sigma	Visualizzazione del materiale C4859	- abbreviato CHX - utilizzato per valutare la connessione SG con traduzione attiva - diluire in acqua a 10 mg/mL
Soluzione salina tamponata con fosfato	Lonza / VWR	95042-486	- abbreviato PBS - tampone di lavaggio per immunofluorescenza
Reagente di paraformaldeide, cristallino	sigma	P6148-500G	- preparare una soluzione al 4% in PBS caldo in cappa aspirante, mescolare fino a quando non si sarà sciolto - le aliquote possono essere conservate a - 20 °C per diversi mesi - pericoloso, utilizzare ventilazione - gettare nei rifiuti speciali
Metanolo, ACS	BDH / VWR	BDH1135-4LP	- pre-refrigerato a -20°C prima dell'uso - gettare nei rifiuti speciali
Siero di cavallo normale	Thermo Fisher Scientifico	Codice: 31874	- abbreviato NHS - diluire al 5% in PBS - aggiungere sodio azide per la conservazione a 4°C - soluzione bloccante per immunofluorescenza
Etanolo, puro, 200 prove (100%), USP, KOPTEC	Decon Labs / VWR	Codice 89125-188	- diluire al 70% con acqua
Fisherbrand Vetrini per microscopio Superfrost Plus	Fisherbrand	12-550-15
Anticorpo di topo anti G3BP1 (TT-Y)	Santa Cruz	SC-81940	- conservare a 4 °C - utilizzare a diluizione 1/100
Anticorpo anti-eIF4G del coniglio (H-300)	Santa Cruz	SC-11373	- conservare a 4 °C - 1/250 di diluizione
Anticorpo anti-eIF3η (N-20) di capra	Santa Cruz	SC-16377	- eIF3η è anche noto come eIF3b - conservare a 4 °C - 1/250 di diluizione
Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Topo IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	715-225-150	- ricostituire in acqua secondo le istruzioni del produttore, quindi conservare a 4°C - 1/250 di diluizione
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Coniglio IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	711-165-152	- ricostituire in acqua secondo le istruzioni del produttore, quindi conservare a 4°C - 1/2500 di diluizione
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Caprino IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	705-175-147	- ricostituire in acqua secondo le istruzioni del produttore, quindi conservare a 4°C - 1/250 di diluizione
Soluzione Hoechst 33258	sigma	94403-1ML	- incubare con anticorpi secondari-soluzione madre 0,5 mg/mL in dH20, proteggere dalla luce- Conservare a 4 °C
20 x buffer SSC	Thermo fisher Ambion	AM9763	- diluire a 2X SSC utilizzando acqua priva di RNasi (trattata con DEPC)- conservare a temperatura ambiente - tampone di lavaggio per FISH
Supporti di montaggio a slitta	fatto in casa	/	- mescolare 5 g di poli(alcol vinilico) "solubile a freddo" in 20 ml di PBS- mescolare mediante sonicazione, quindi agitare per una notte a RT- Aggiungere 5 ml di glicerolo e 0,2 ml di azoturo di sodio al 20 % e agitare per 16 ore a RT- centrifugazione a 20.000 g per 20 minuti, scartare il liquido viscoso aliquota di pellet grande, conservazione a lungo termine a -20°C, 1 settimana a 4°C
Parafilm "M"	sigma	P7793-1EA	- Di solito indicato come "parafilm"
Poli(alcol vinilico)	sigma	P-8136-250G	- Reagente per fare Vinol
glicerolo	sigma	G5516-100ML	- Reagente per fare Vinol
Aziduro di sodio	Fisher Scientifico	S2002-5G	- conservante per soluzione bloccante e vinol - Effettuare una diluizione del 20 % in acqua