Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.
1. Preparazione del saggio
- Raccogliere, preparare e organizzare i materiali specificati per la procedura (fare riferimento alla Tabella dei materiali/attrezzature specifiche).
- Etichetta tubi 12 x 75 mm.
- Etichettare due provette per ciascun partecipante: una provetta per il test di fagocitosi (etichettare questa provetta con inchiostro nero e una "F" per l'isotiocianato di fluoresceina [FITC]) e una provetta per il test di attività del burst ossidativo (OB) (etichettare questa provetta con inchiostro rosso e una "H" per il diidroetidio [HE]).
nota: Si consiglia l'uso di tubi sterili da 12 x 75 mm per ridurre al minimo l'attivazione cellulare involontaria e l'aumento associato del rumore di fondo.
- Etichettare tre provette per i controlli del test: una provetta per il test di fagocitosi (controllo FITC: etichettare questa provetta con inchiostro nero e una "F"), una provetta per il test dell'attività OB (controllo HE: etichettare questa provetta con inchiostro rosso e una "H") e una provetta per il controllo negativo (Solo sangue: etichettare questa provetta con inchiostro verde e "solo sangue").
- Preparare le soluzioni madre almeno un giorno prima del giorno del saggio.
- Preparare la soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS). Diluire 100 ml di 10x PBS con 900 ml di 18,2 MΩ H2O. Filtro sterilizzare con un filtro da 0,2 μm. Conservare a 4 °C fino al momento dell'uso.
- Preparare il glucosio PBS sterile. Sciogliere 1,0 g di glucosio in 100 ml di PBS. Sterilizzare il filtro con un filtro da 0,2 μm. Conservare a 4 °C fino al momento dell'uso.
- Preparare il tampone sterile di citrato 0,1 M. Sciogliere 1,2 g di acido citrico e 1,1 g di citrato di sodio in 100 ml di 18,2 MΩ H2O. Regolare il pH a 4,0. Sterilizzare il filtro con un filtro da 0,2 μm. Conservare a 4 °C fino al momento dell'uso.
- Preparare la soluzione stock HE. Risospendere 1,0 mg di HE in 1,0 ml di dimetilsolfossido (DMSO). Mescolare delicatamente, aliquotare e conservare a -20 °C fino al momento dell'utilizzo.
- Preparare la soluzione madre di Staphylococcus aureus (S. aureus) marcata con FITC (2 x 109 particelle/ml). Risospendere 10 mg di S. aureus marcato con FITC in 1,5 ml (o quantità appropriata) di PBS. Dividere in tre aliquote da 500 μl e sonicare secondo le raccomandazioni del produttore. Aliquotare e conservare a -20 °C fino al momento dell'uso.
- Preparare la soluzione madre di S. aureus non marcata (2 x 109 particelle/ml). Risospendere 100 mg di S. aureus non marcato in 15 ml (o quantità appropriata) di PBS. Dividere in trenta aliquote da 500 μl e sonicare secondo le raccomandazioni del produttore. Aliquotare e conservare a -20 °C fino al momento dell'uso.
- Preparare nuove soluzioni di lavoro il giorno del test.
- Preparare la soluzione funzionante HE. Trasferire 10 μl di soluzione madre di HE scongelata in 990 μl di PBS-glucosio. Proteggere dalla luce e tenere in ghiaccio fino al momento dell'uso.
- Preparare la soluzione di lavoro di S. aureus marcata con FITC (133.333 particelle/μl). Trasferire 70 μl di soluzione madre di S. aureus scongelata marcata con FITC a 980 μl di PBS. Proteggere dalla luce e tenere in ghiaccio fino al momento dell'uso.
- Preparare la soluzione di lavoro non marcata di S. aureus (133.333 particelle/μl). Trasferire 70 μl di soluzione madre scongelata non marcata di S. aureus a 980 μl di PBS. Proteggere dalla luce e tenere in ghiaccio fino al momento dell'uso.
- Preparare la soluzione di spegnimento. Aggiungere 750 μl di soluzione di blu di tripano allo 0,4% a 11,25 ml di tampone sterile 0,1 M di citrato. Conservare a bagnomaria fino al momento dell'uso.
- Chiedi a un flebotomo certificato di prelevare il sangue secondo le linee guida dell'Organizzazione Mondiale della Sanità per il prelievo di sangue.
- Aspirare il sangue in una provetta per la raccolta del sangue da 4 ml contenente acido dipotassico etilendiamminotetraacetico (K2EDTA). Capovolgere la provetta per la raccolta del sangue secondo le istruzioni del produttore. Tenere la provetta per la raccolta del sangue a temperatura ambiente su un bilanciere da banco fino al momento dell'uso. Utilizzare questo sangue per l'emocromo completo (CBC) con analisi differenziale dei globuli bianchi (WBC) descritta al passaggio 1.2.1.
- Aspirare il sangue in una provetta da 4 ml contenente litio eparina. Capovolgere la provetta per la raccolta del sangue secondo le istruzioni del produttore. Tenere la provetta per la raccolta del sangue a temperatura ambiente (RT) su un bilanciere da banco fino all'uso. Utilizzare questo sangue per il test di fagocitosi e attività ostetrica di monociti e granulociti descritto nel passaggio 2.
- Determinare la quantità di batteri (ad es. S. aureus) che sarà necessaria per completare il test per ciascun campione.
- Utilizzare un analizzatore ematologico per eseguire un CBC con analisi differenziale dei globuli bianchi sul sangue come descritto nelle istruzioni del produttore. Prendere nota della conta leucocitaria (in cellule/ml), dei valori di %Neutrofili e %Monociti.
- Utilizzare le equazioni seguenti per determinare la conta dei neutrofili e dei monociti per ciascun campione.
Conta dei neutrofili (in cellule/ml) = %Neutrofili × WBC (in cellule/ml)
Conta dei monociti (in cellule/ml) = % Monociti × globuli bianchi (in cellule/ml)
- Utilizzare le equazioni seguenti per determinare la conta dei fagociti per ciascun campione e il numero di fagociti presenti in 100 μl del campione.
Conta dei fagociti (in cellule/ml) = Conta dei neutrofili (in cellule/ml) + Conta dei monociti (in cellule/ml)
Numero di fagociti in 100 μl = (Conta dei fagociti (in cellule/ml))/10
- Utilizzare l'equazione seguente per determinare il numero di batteri (ad esempio, S. aureus) necessari per ciascun campione e la quantità di soluzione di lavoro di S. aureus marcata con FITC o S. aureus non marcata (133.333 particelle/ml) che deve essere aggiunta a ciascuna provetta.
nota: Il rapporto batteri/fagociti bersaglio è 8:1,
Numero di batteri necessari = Numero di fagociti in 100 μl × 8
Volume di FITC o soluzione di lavoro non marcata necessaria (in μl) = (numero di batteri necessari)/(133.333 particelle/μl)
2. Esegui saggio
- Preparare il sangue intero per il test.
- Per ogni partecipante e provetta di controllo, utilizzare una punta per pipetta di lunghezza estesa per trasferire 100 μl di sangue intero dalla provetta per la raccolta del sangue con litio eparina al fondo di una provetta da 12 x 75 mm adeguatamente etichettata. Sostituire caps.
nota: Fare attenzione a non far entrare sangue sui lati dei tubi da 12 x 75 mm.
- Utilizzare una micropipetta per aggiungere 10 μl di soluzione di lavoro HE alle provette etichettate con inchiostro rosso e una "H", compresa la provetta di controllo HE. Riposizionare brevemente i tappi e il vortice.
- Incubare tutte le provette in un bagno d'acqua a 37 °C per 15 minuti. Quindi, trasferire immediatamente tutti i tubi in un bagno di acqua ghiacciata per 12 minuti.
nota: Utilizzare un rack di metallo aperto e scuotere delicatamente il rack ogni 5 minuti per assicurarsi che le provette siano riscaldate o raffreddate rapidamente e adeguatamente.
- Aggiungere batteri (ad es. S. aureus) al campione e alle provette di controllo.
- Utilizzare una micropipetta per aggiungere la quantità appropriata (calcolata al punto 1.2.4) di soluzione di lavoro di S. aureus non marcata alle provette etichettate con inchiostro rosso e una "H", compresa la provetta di controllo HE. Riposizionare brevemente i tappi e il vortice.
- Utilizzare una micropipetta per aggiungere la quantità appropriata (calcolata al punto 1.2.4) di soluzione di lavoro di S. aureus marcata con FITC alle provette etichettate con inchiostro nero e una "F", compresa la provetta di controllo FITC. Riposizionare brevemente i tappi e il vortice.
- Agitare la provetta di controllo "solo sangue", ma non aggiungere nessuno dei due tipi di batteri (ad esempio, S. aureus).
- Incubare tutte le provette in un bagno d'acqua a 37 °C per 20 minuti. Utilizzare un rack metallico aperto e agitare delicatamente il rack ogni 5 minuti per assicurarsi che le provette siano riscaldate rapidamente e adeguatamente. Trascorso il periodo di incubazione, trasferire immediatamente tutte le provette in un bagno di acqua ghiacciata per 1 minuto.
- Lavare le celle.
- Utilizzare una pipetta a ripetizione per aggiungere 100 μl di soluzione di quench ghiacciata a tutte le provette. Riposizionare i tappi, agitare brevemente e quindi incubare tutte le provette sul ghiaccio per 1 minuto.
- Utilizzare una pipetta a ripetizione per aggiungere 1 ml di PBS ghiacciato a tutte le provette. Agitare brevemente, quindi aggiungere altri 2 ml di PBS ghiacciato a tutte le provette e riposizionare i tappi. Centrifugare tutte le provette per 5 minuti a 4 °C e 270 x g, quindi aspirare il surnatante.
- Ripetere il passaggio 2.3.2 una volta (totale di 2 lavaggi).
- Preparare i campioni per la citometria a flusso.
- Utilizzare una pipetta a ripetizione per aggiungere 50 μl di siero fetale bovino ghiacciato a tutte le provette. Agitare brevemente tutti i tubi.
- Trasferire tutte le provette in un carosello appropriato e utilizzare una stazione di lavoro automatizzata per la preparazione della lisi cellulare con reagenti per la lisi dei globuli rossi (RBC) e il fissaggio dei globuli bianchi per lisare i globuli rossi e fissare i globuli bianchi come descritto nelle istruzioni del produttore.
