Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Configurazione sperimentale
- Utilizzare fogli di carta da filtro (fogli di poliestere idrossilato fibroso, vedere la Tabella dei materiali).
- Ritaglia strisce di dimensioni 3 x 15 mm per un bambino di 1 mese e a forma di L per bambini più grandi e adulti (5 x 20 x 10 mm (braccio corto della L)).
- Inserisci un pezzo di carta da filtro in ciascuna narice di un neonato usando una pinza. Posizionare la carta da filtro nella parte anteriore del turbinato inferiore (circa 1 cm all'interno della narice per i neonati e 1,5 cm per tutte le altre età).
- Metti i neonati su un letto e dai loro acqua zuccherata per il comfort.
nota: Per i bambini di tutte le altre età, il campionamento viene eseguito più facilmente con il soggetto seduto su una sedia.
- Per i bambini più grandi, inserire il braccio lungo della carta da filtro a forma di L in ciascuna narice.
- Applicare una clip per il naso intorno alle narici per ridurre al minimo il disagio ed evitare la perdita accidentale della carta da filtro.
- Rimuovere la carta da filtro dopo 2 minuti di assorbimento.
- Mettere la carta da filtro in tubi etichettati e congelarla immediatamente a -80 °C.
- Prendere nota di eventuali sintomi di infezione delle vie aeree mostrati dal bambino il giorno del prelievo.
- Registrare eventuali starnuti, pianti persistenti o epistassi che si verificano durante i 2 minuti di campionamento.
2. Quantificazione dei mediatori immunitari delle vie aeree
- Prelevare fino a 10 campioni casuali dal congelatore. Registrare i numeri di identificazione. Mantenere i campioni in ghiaccio durante l'intero processo di lavorazione.
- Dopo lo scongelamento con ghiaccio, immergere le carte da filtro (per soggetto) da entrambe le narici in 300 μl di tampone appena preparato (vedere la Tabella dei materiali) contenente una compressa completa di inibitore della proteasi (vedere la Tabella dei materiali) per 25 mL di tampone.
- Regolare il volume del tampone in base alle dimensioni della carta da filtro.
- Utilizzare 300 μl di tampone per carte da filtro di dimensioni 3 x 15 mm.
- Se è disponibile una sola carta da filtro, utilizzare metà del volume del tampone (150 μl).
- Trasferire i campioni in un agitatore a piastre (400 giri/min) per 5 minuti. Utilizzare un timer.
- Trasferire la carta da filtro umida e il tampone di analisi nella tazza di un filtro in acetato di cellulosa (dimensione dei pori di 0,22 μm) posizionato all'interno di una provetta da microcentrifuga (vedere la Tabella dei materiali).
- Centrifugare a 16.000 x g per 5 minuti in centrifuga raffreddata (a 4 °C) per ottenere l'estratto nasale filtrato nella provetta.
- Rimuovere la coppetta e mantenere i tubi sul ghiaccio mentre si aliquota l'estratto nasale nei pozzetti delle piastre di conservazione a basso contenuto proteico (vedere Tabella dei materiali).
- Conservare a -80 °C fino all'analisi.
- Determinare le concentrazioni di citochine e chemochine negli estratti nasali utilizzando un sistema di array multiplex ad alta sensibilità, basato sull'elettrochemiluminescenza (vedere la Tabella dei materiali).
e: Qui sono stati eseguiti un test di citochine umane 10-plex TH1/TH2, un test di chemochine 9-plex e interleuchina-17A a plesso singolo (IL-17A), fattore di crescita trasformante-beta1 (TGF-β1) e linfopoietina stromale timomica (TSLP).
- Per i test, incubare gli estratti nasali per una notte a 4 °C. Effettuare le misurazioni secondo il protocollo standard del produttore (vedere la Tabella dei materiali).
nota: I test immunologici (vedere la Tabella dei materiali) hanno in genere un intervallo dinamico elevato per la misurazione compreso tra 1 e 10.000 pg/mL, ma per alcuni test può essere di 100.000 pg/mL. Ciò significa che tutti i campioni possono essere analizzati alla stessa diluizione, limitando così l'influenza di diluizioni dissimili in soggetti sani e malati, come nel caso di altri test immunologici simili. Il limite inferiore di rilevazione per tutte le citochine era di 1 pg/mL o meno, e per le chemochine, variava tra 1 e 50 pg/mL. La TSLP non era rilevabile nel 98% dei campioni a 1 mese di età.
