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1. Progettazione e preparazione dei peptidi
- Acquisire la sequenza della proteina di fusione di interesse da un database pubblico come NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) o il database dei patogeni virali (https://www.viprbrc.org). Scegliere il sito di riconoscimento della proteasi che precede il peptide di fusione e includere 2-3 amminoacidi a monte e a valle di questa sequenza.
- Quando si ordinano i peptidi, modificarli con la coppia FRET 7-metossicumarina-4-il acetil (MCA) all'N-terminale e N-2,4-dinitrofenile (DNP) all'estremità C.
nota: Diversi fornitori forniscono queste modifiche. Il prezzo e i tempi di consegna dipendono dal fornitore scelto. Tuttavia, esistono modifiche alternative che variano in sensibilità e richiedono regolazioni del lettore di piastre in termini di lunghezze d'onda.
- Risospendere il peptide secondo le raccomandazioni del produttore pipettandolo delicatamente su e giù. Ad esempio, risospendere i peptidi in etanolo al 70% alla concentrazione finale di 1 mM.
- Facoltativamente, aggiungere la provetta contenente il peptide e il solvente in un bagno di sonicazione fino a quando non è completamente risospesa se il peptide non si ripropone molto bene mediante pipettaggio.
- Aliquotare il peptide in tubi che smorzano la luce o sono resistenti per proteggere il peptide dallo sbiancamento. Mantenere le dimensioni delle aliquote piccole per evitare più cicli di congelamento/scongelamento (ad esempio, 100 μL). Conservare le aliquote a -20° C.
2. Preparazione del lettore di piastre a fluorescenza
- Accendere il lettore di piastre e attendere il termine dell'autotest.
- Aprire il software operativo sul computer collegato e assicurarsi che sia collegato al lettore di piastre.
- Aprire l'impostazione della temperatura e impostarla su 30 °C (o la temperatura richiesta per prestazioni ottimali della proteasi).
- Fare clic su Controllo | Configurazione dello strumento per impostare l'esperimento.
- Scegliete Cinetico (Kinetic).
- Seleziona Fluorescenza.
- Inserire le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione: 330 nm e 390 nm rispettivamente.
- Deselezionate Interruzione automatica.
- Selezionare Media, sensibilità normale.
- Scegliere un tempo di esecuzione di 1 ora per il test e selezionare una misurazione ogni 60 s.
- Impostare 5 secondi di miscelazione prima della prima misurazione e 3 secondi prima di ogni misurazione
- Selezionare i pozzetti da leggere e avviare il saggio.
3. Preparazione del test
- Preparare il tampone di analisi calcolando le quantità appropriate per ciascun ingrediente e aggiungendolo. Per la furina, preparare un tampone composto da 100 mM di HEPES, 1 mM di CaCl2, 1 mM di 2-mercaptoetanolo e il 5% di Triton X-100. Per la tripsina, utilizzare una soluzione salina standard tamponata con fosfato (PBS).
nota: Sono sufficienti volumi di 10 ml o meno. A seconda della proteasi o delle proteasi utilizzate nel test, il tampone varia.
- Raffreddare il tampone con ghiaccio.
- Posizionare la piastra del saggio sul ghiaccio con una sottile piastra metallica sottostante per favorire il raffreddamento e la stabilità. Utilizzare una piastra solida in polistirene nero a 96 pozzetti con fondo piatto e non trattata.
nota: È essenziale utilizzare piastre nere per evitare "perdite" fluorescenti dai pozzetti adiacenti.
- Calcolare la quantità appropriata di proteasi da aggiungere per ogni reazione in base a pubblicazioni precedenti o dati sperimentali. Per la furina, utilizzare 1 unità per reazione che corrisponde a 0,5 μl. Per la tripsina, utilizzare 0,5 μL di tripsina TPCK da 160 nM.
- Per campione preparare 3 repliche tecniche per saggio in un volume totale di 100 μl per campione.
nota: È stato valutato sperimentalmente che non fa differenza se il pipettaggio viene eseguito in condizioni di luce normale o in condizioni di luce attenuata. Tuttavia, i peptidi non devono essere esposti alla luce per un lungo periodo di tempo.
- Pipettare la quantità appropriata di tampone per il saggio (94,5 μl come descritto al punto 3.1) in ciascun pozzetto.
- Aggiungi la proteasi a ciascun pozzetto. Sia per la furina che per la tripsina TPCK, utilizzare 0,5 μl per campione. A 6 pozzetti (3 pozzetti per un controllo in bianco e 3 pozzetti per un controllo peptidico), aggiungere 0,5 μL di tampone invece della rispettiva proteasi.
- Aggiungere il peptide a una concentrazione finale di 50 μM in ciascun pozzetto, ad eccezione del controllo in bianco. In questo caso, è stata preparata la pipetta da 5 μl di peptide come descritto al punto 1.3. Aggiungere 5 μl di tampone al controllo bianco invece del peptide.
nota: Diverse concentrazioni del peptide sono state inizialmente testate con le concentrazioni enzimatiche descritte per garantire che gli enzimi fossero saturi.
- Inserire la piastra nel lettore di piastre a fluorescenza e fare clic su Start.