Un saggio di scissione del peptide fluorogenico per lo screening dell'attività proteolitica delle proteasi

Abstract

Fonte: Jaimes, J. A., et al. Un test di scissione del peptide fluorogenico per lo screening dell'attività proteolitica: applicazioni per l'attivazione della proteina spike del coronavirus. (2019).

Questo video mostra un test per lo screening dell'attività proteolitica delle proteasi utilizzando peptidi fluorogenici. La proteasi riconosce il suo sito di scissione sul peptide, scorporandolo e separando il quencher dal fluoroforo, consentendone l'emissione di fluorescenza. Il segnale di fluorescenza viene rilevato e analizzato per verificare l'efficienza di scissione di diverse varianti peptidiche.

Protocol

1. Progettazione e preparazione dei peptidi

1. Acquisire la sequenza della proteina di fusione di interesse da un database pubblico come NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) o il database dei patogeni virali (https://www.viprbrc.org). Scegliere il sito di riconoscimento della proteasi che precede il peptide di fusione e includere 2-3 amminoacidi a monte e a valle di questa sequenza.
2. Quando si ordinano i peptidi, modificarli con la coppia FRET 7-metossicumarina-4-il acetil (MCA) all'N-terminale e N-2,4-dinitrofenile (DNP) all'estremità C.
   nota: Diversi fornitori forniscono queste modifiche. Il prezzo e i tempi....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
peptidi	Biomatik	N/A
Furina	Neb	P8077S
Tripsina, trattata con TPCK	Sigma-Aldrich	4352157-1KT
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
CaCl2	Sigma-Aldrich	Visualizzazione del materiale C1016
2-mercaptoetanolo	Sigma-Aldrich	Motore M6250
Tritone-X100	Sigma-Aldrich	X100
Pbs	Corning	21-040-CV
SpectraMax Gemini XPS	Dispositivi molecolari	XPS
SoftMax Pro 6.5.1	Dispositivi molecolari	N/A
Piastra a 96 pozzetti (polistirene nero solido a fondo piatto e non trattato)	Costar	3915
Tubi di smorzamento della luce	Laboratorio Watson	131-915BL o 131-915BR