Monitoraggio dell'arrivo di proteine di superficie marcate con GFP nella rete trans-Golgi utilizzando nanocorpi funzionalizzati

Abstract

Fonte: Buser, D. P., et al. Analisi dell'assorbimento endocitico e del trasporto retrogrado alla rete trans-Golgi utilizzando nanocorpi funzionalizzati in cellule in coltura. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video dimostra un metodo per studiare l'assorbimento e il trasporto retrogrado di nanocorpi funzionalizzati per comprendere i loro percorsi di traffico intracellulare. Introducendo il solfato radiomarcato e utilizzando tecniche di isolamento e rilevamento, questo metodo consente lo studio dell'assorbimento endocitico e dell'arrivo nella rete trans-Golgi delle proteine cargo.

Protocollo

1. Assorbimento di nanocorpi funzionalizzati da parte di cellule coltivate (per analisi di solfatazione)

1. In una cappa di coltura cellulare, seminare da ~400.000 a 500.000 cellule HeLa che esprimono stabilmente una proteina reporter marcata con GFP in piastre da 35 mm o su cluster a 6 pozzetti con terreno completo contenente antibiotici (terreno Dulbecco's Modified Eagle, DMEM, integrato con il 10% di siero fetale di vitello (FCS), 100 unità/mL di streptomicina, 2 mM di l-glutammina e 1,5 μg/mL di puromicina).
   nota: Come accennato in precedenza, qui utilizziamo cellule HeLa che esprimono stabilmente EGFP-Calnexin, EGFP-CDMPR e TfR-EGFP a scopo illustrativo. Oltre alle linee cellulari stabili, è possibile utilizzare anche HeLa trasfettato transitoriamente.
2. Incubare le cellule O/N a 37 °C in un incubatore al 7,5% di CO₂ per farle proliferare.
   nota: Le celle dovrebbero avere una confluenza di ~80% il giorno successivo.
3. Rimuovere l'intero terreno, lavare 2 volte con 1x PBS a RT e far affamare le cellule con terreno privo di solfati (SFM) per 1 ora a 37 °C in un incubatore al 7,5% di CO₂.
   nota: La SFM viene preparata aggiungendo 10 mL di soluzione di amminoacidi MEM (50x), 5 mL di L-glutammina (200 mM), 5 mL di soluzione vitaminica (100x) e 900 μL di CaCl₂·2H₂O a 500 mL di sali bilanciati di Eagle. Passare attraverso un filtro da 0,22 μm e aliquota.
4. In una cappa ventilata o in un banco adibito a lavori di radioattività, preparare un mezzo di marcatura dei solfati contenente 0,5 mCi/mL [³⁵S] solfato come sale di sodio in SFM.
   cautela: Maneggiare con cura tutte le soluzioni contenenti radioattività. Lavorare solo nelle cappe o nelle panche designate. Tutto il materiale (punte, provette, piastre, ecc.) o i tamponi di lavaggio a contatto con la radioattività devono essere raccolti e smaltiti separatamente. Fallo anche per tutti i passaggi seguenti (passaggi 1.5-1.18).
5. Aggiungere VHH-2xTS in 1x PBS nel terreno di marcatura dei solfati fino a una concentrazione finale di 2 μg/mL.
   nota: Come controllo, includere anche VHH-std o un altro nanocorpo privo di siti TS per dimostrare l'etichettatura specifica.
6. Sostituire l'SFM con 0,7 mL di terreno di marcatura dei solfati contenente 0,5 mCi/mL di [35S]solfato e 2 μg/mL di VHH-2xTS e incubare le cellule per 1 ora a 37 °C in un incubatore al 7,5% di CO₂ destinato a lavorare con la radioattività.
   nota: A seconda dell'esperimento pianificato, il tempo di solfatazione dei nanocorpi deve essere regolato. Inoltre, per determinare la cinetica di arrivo del TGN, l'etichettatura viene eseguita per tempi diversi (ad esempio, per 10 min, 20 min, 30 min, ecc.).
7. Rimuovere il mezzo di etichettatura e lavare le celle 2-3 volte con 1x PBS ghiacciato su una piastra di raffreddamento o ghiaccio.
8. Aggiungere 1 mL di tampone di lisi (PBS contenente l'1% di Triton X-100 e lo 0,5% di desossicolato) integrato con 2 mM di PMSF e 1x cocktail di inibitori della proteasi e incubare le cellule per 10-15 minuti su una piattaforma oscillante a 4 °C.
9. Raschiare e trasferire il lisato in una provetta da 1,5 mL, agitare il lisato e posizionarlo per 10-15 minuti su un rotatore end-over-end a 4 °C.
10. Preparare un lisato postnucleare mediante centrifugazione a 10.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
11. Utilizzando una nuova provetta da 1,5 mL, preparare 20-30 μL di un impasto di perle di nichel in una provetta da 1,5 mL e lavare una volta con 1x PBS pellettandole delicatamente a 1.000 x g per 1 min.
    nota: Al posto delle perle di nichel, possono essere utilizzate perle di streptavidina (se il nanocorpo è biotinilato) o perle di proteina A con una IgG contro un epitopo del nanocorpo (T7- o HA-tag).
12. Trasferire il lisato postnucleare in una provetta da 1,5 mL contenente perle di nichel e incubare per 1 ora a 4 °C su un rotatore end-over-end per isolare i nanocorpi. Rimuovere un'aliquota (50-100 μL) del lisato postnucleare e far bollire nel tampone del campione SDS per la successiva analisi immunoblot del nanocorpo associato alla cellula totale, il reporter GFP e il controllo del carico.
13. Lavare le perle 3 volte con 1x PBS o tampone di lisi pellettando delicatamente a 1.000 x g per 1 min.
    nota: Per un lavaggio più rigoroso delle sfere, 20 mM di imidazolo possono essere inclusi nel tampone PBS o in lisi.
14. Rimuovere con cautela tutto il tampone di lavaggio dalle perline, aggiungere 50 μl di tampone campione 2x e far bollire per 5 minuti a 95 °C.
15. Caricare entrambe le perle bollite su un gel midi 12,5% SDS-PAGE e far funzionare secondo il protocollo standard PAGE fino a quando il colorante di riferimento (ad es. blu di bromofenolo) ha raggiunto la fine del gel separatore.
    nota: L'analisi immunoblot del nanocorpo associato alla cellula totale, del reporter GFP e del controllo del carico può essere eseguita anche utilizzando un mini SDS-PAGE al 12,5% o un gel a gradiente prefabbricato.
16. Fissare il gel separatore in ~30 mL di tampone di fissazione (10% di acido acetico e 45% di metanolo in ddH₂O) per 1 ora a RT, lavare il gel tre volte con ~50 mL di acqua deionizzata e prepararsi per l'asciugatura del gel.
17. Essiccazione dei gel SDS-PAGE.​
    1. Posizionare con cura il gel fissato su pellicola trasparente tesa e coprirlo con carta da filtro pretagliata.
    2. Posizionare il gel con la carta da filtro sopra la piattaforma di asciugatura, posizionare il coperchio del vuoto e accendere la pompa del vuoto per l'essiccazione del gel. Asciugare il gel per 3-5 ore.
    3. Rimuovere la pellicola trasparente e inserire il gel essiccato in una cassetta per autoradiografia dotata di schermo al fosforo.
18. Autoradiografia delle immagini utilizzando un Phosphor Screen Imager. Seguire le istruzioni del produttore.
    nota: A seconda della potenza del segnale, i gel essiccati devono essere esposti più a lungo con gli schermi al fosforo.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Anticorpo anti-GFP	Sigma-Aldrich	1.18145E+11	Il prodotto è distribuito da SigmaAldrich, ma fabbricato da Roche
Medium dell'aquila modificato di Dulbecco (DMEM)	Sigma-Aldrich
Siero fetale di vitello (FCS)	Bioovest
Zolfo-35 come solfato di sodio	Analisi Hartmann	ARS0105	Il prodotto contiene 5 mCi
Piastre a 6 pozzetti	TPP	Codice 92406
Paraformaldeide (PFA)	Applichem	A3813
Fluoromount-G	Biotecnologie del sud	Codice 0100-01
Gel Mini-Protean TGX, 4-20%, 15 pozzetti	Bio-Rad	456-1096