Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Cultura dei parassiti
NOTA: Segui le normative locali per la gestione dei patogeni umani.
- Mantenere i parassiti Plasmodium falciparum secondo il protocollo standard come descritto in precedenza nel terreno di coltura dei parassiti (vedi Tabella dei materiali).
- Mantenere i parassiti strettamente sincronizzati utilizzando il trattamento con sorbitolo come descritto in precedenza.
- Per garantire VAR2CSA espressione sulla superficie degli eritrociti infetti da Plasmodium falciparum (IE), eseguire cicli ripetuti di selezione immuno-magnetica utilizzando un anticorpo anti-VAR2CSA (ad esempio, l'anticorpo PAM1.4, un monoclonale umano cross-reattivo VAR2CSA-specifiche IgG) accoppiato a perline magnetiche di proteina G.
- In breve, incubare trofozoiti-IE in stadio avanzato con perle magnetiche accoppiate a un anticorpo anti-VAR2CSA e selezionare positivamente utilizzando un magnete.
- Espandere i parassiti selezionati in coltura per alcuni cicli fino a quando la parassitemia non raggiunge almeno il 5%.
- In alternativa, selezionare i parassiti che si legano al CSA immobilizzato in plastica (il recettore per il VAR2CSA) come descritto in precedenza.
- Per verificare l'espressione VAR2CSA sui parassiti selezionati, eseguire la citometria a flusso come descritto in precedenza.
- In breve, etichettare i trofozoiti-IE in stadio avanzato con lo stesso anticorpo utilizzato per la selezione magnetica (passaggio 1.3) seguito da un anticorpo secondario marcato in fluorescenza.
- Misurare la reattività superficiale dell'IE mediante citometria a flusso. Una selezione di anticorpi di successo normalmente si traduce in una popolazione di parassiti che esprime VAR2CSA nella maggior parte dei parassiti (≈80%).
- Per il test della fagocitosi, utilizzare trofozoiti-IE purificati in stadio medio-avanzato. Eseguire la purificazione utilizzando la separazione magnetica come descritto in precedenza.
nota: Per determinare con precisione lo stadio dei parassiti, eseguire la colorazione Giemsa sugli strisci di sangue seguita dall'osservazione al microscopio ottico. Seguire le procedure standard e le linee guida morfologiche come descritto in precedenza. La purificazione in fase avanzata può essere eseguita anche utilizzando un mezzo a gradiente di densità. La resa IE, tuttavia, nella nostra esperienza è inferiore, e, quindi, la purificazione magnetica è preferibile.
- Per la separazione magnetica, centrifugare la coltura del parassita (parassitemia al 5-10%) a 500 x g per 10 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 mL di terreno di coltura antiparassitaria.
- Aggiungere la sospensione parassita in una colonna di silice Claricep Flash accoppiata a un magnete (vedi Tabella dei materiali) e lasciarla passare lentamente attraverso la colonna. I trofozoiti-IE sono paramagnetici (a causa della presenza di emozoina) e rimarranno nella maglia della colonna.
- Lavare la colonna con 50 mL di terreno di coltura per parassiti ed eluire gli IE dalla colonna magnetica utilizzando 50 mL di terreno di coltura per parassiti.
- Centrifugare l'eluato da 1,5,3 a 500 x g per 10 minuti a temperatura ambiente. Scartare con cautela il surnatante e risospenderlo in 1 mL di terreno di coltura antiparassitario.
- Utilizzando un emocitometro, contare il numero di IE (facilmente identificabili al microscopio ottico come eritrociti con pigmento di emozoina scuro) e il numero totale di cellule per calcolare la parassitemia finale (percentuale di IE).
nota: Utilizzare solo parassiti con almeno l'80% di purezza (80% IE).
- Sulla base del numero di campioni di siero/anticorpi pianificati per i test, stimare la quantità totale di IE necessari e aumentare di conseguenza le colture di parassiti. Un pallone di coltura da 75 cm2 con 25 mL di coltura al 5% di ematocrito e al 5-10% di parassitemia dovrebbe produrre IE sufficienti per eseguire una piastra completa a 96 pozzetti. Per una piastra completa (42 campioni più 6 controlli in duplicato), è necessario un minimo di 1,5 mL di sospensione di parassiti a 3,3 x 107 IE/mL.
2. Celle THP-1
NOTA: In questo test viene utilizzata la linea cellulare THP-1. Questa linea cellulare di monociti è derivata da un paziente con leucemia monocitica e può essere acquistata dall'American Type Culture Collection (ATCC). Mantenere la linea cellulare secondo le istruzioni del fornitore nel terreno di coltura THP-1 (vedere la Tabella dei materiali).
- Per una manutenzione regolare, iniziare la coltura cellulare THP-1 a 2-4 x 105 cellule/mL e la sottocoltura quando la concentrazione cellulare raggiunge 8 x 105 cellule/mL.
nota: Non lasciare che la concentrazione di cellule superi 1 x 106 cellule/mL e tenere traccia del numero di passaggio. Evitare l'uso di celle che si trovano oltre il passaggio 25. Il tempo medio di raddoppio della linea cellulare THP-1 varia tra le 19 e le 50 ore. Determinare il tempo di raddoppio del lotto di cellule prima di iniziare gli esperimenti di fagocitosi. Ciò contribuirà a stimare approssimativamente la quantità necessaria di coltura necessaria per un determinato numero di campioni di siero da analizzare (ad esempio, per una piastra completa da 96 pozzetti, sono necessari 10 mL di coltura a 5 x 105 cellule/mL).
- Controllare periodicamente le cellule THP-1 per l'espressione superficiale dei recettori Fcγ I (CD64), II (CD32) e III (CD16) come precedentemente descritto.
- In breve, colorare le cellule THP-1 (separatamente) con anticorpi anti-CD64, anti-CD32 e anti-CD16 marcati in fluorescenza (Tabella dei materiali) per 30 minuti a temperatura ambiente (diluizione 1:100 preparata in siero fetale bovino al 2% (FBS) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
- Lavare tre volte con FBS al 2% in PBS e misurare la colorazione superficiale mediante citometria a flusso.
nota: Le cellule THP-1 sono negative per CD16 e positive per CD32 e CD64 come riportato in precedenza (Figura 1).
- Per il test di fagocitosi, impostare un pallone di coltura cellulare THP-1 con 2,5 x 105 cellule/mL il giorno prima dell'esperimento per produrre circa 5 x 105 cellule/mL il giorno del saggio.
nota: Assicurarsi che il giorno del test siano presenti 4-6 x 105 cellule/mL.
3. Saggio di fagocitosi (Figura 2)
- Prima di iniziare il saggio, bloccare (>1 h) due piastre a fondo tondo da 96 pozzetti (una per l'opsonizzazione e l'altra per la fagocitosi) utilizzando 150 μL per pozzetto di FBS sterile al 2% in PBS.
nota: Etichettare la targhetta 1 come piastra di opsonizzazione e utilizzarla sia per la colorazione con bromuro di etidio (EtBr) che per l'opsonizzazione. Etichettare la targhetta 2 come piastra per fagocitosi e utilizzarla sia per la placcatura cellulare THP-1 che per la fase di fagocitosi.
- Colorazione e opsonizzazione dei parassiti
- Prendere la sospensione IE preparata in 1,6 e regolare la conta cellulare a 3,3 x 107 IE/mL aggiungendo terreno di coltura parassita e bromuro di etidio (EtBr) per ottenere una concentrazione finale di 2,5 μg/mL (diluizione 1:40, da uno stock di 0,1 mg/mL).
nota: L'EtBr colora il DNA del parassita, consentendo il rilevamento mediante citometria a flusso.
cautela: L'EtBr è un mutageno e irritante per la pelle, gli occhi e le vie respiratorie. Utilizzare una protezione adeguata e smaltire i rifiuti secondo le normative locali.
- Rimuovere la soluzione bloccante da una delle piastre a 96 pozzetti (piastra di opsonizzazione), muovendo la piastra e rimuovendo il liquido in eccesso su un pezzo di carta assorbente.
- Aggiungere 30 μl per pozzetto della sospensione IE preparata sopra nella metà superiore della piastra. Lasciare un pozzetto vuoto e aggiungere 30 μL di terreno di coltura del parassita (senza IE per il solo controllo THP-1). (Figura 3A). Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente e al riparo dalla luce.
- Aggiungere 170 μl per pozzetto di terreno di coltura antiparassitario. Centrifugare la piastra a 500 x g per 3 minuti a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante facendo scorrere la piastra su un apposito contenitore per rifiuti.
- Lavare gli IE marcati con EtBr altre due volte utilizzando 200 μl per pozzetto di terreno di coltura di parassiti, ruotando la piastra a 500 x g per 3 minuti a temperatura ambiente. Il surnatante del primo lavaggio può essere rimosso muovendo la piastra. Rimuovere con cautela il surnatante dal secondo lavaggio utilizzando una pipetta multicanale per assicurarsi che l'intero volume del mezzo di lavaggio venga rimosso. Non disturbare il pellet.
- Risospendere gli IE marcati con EtBr in 30 μL di soluzione di anticorpo/plasma/siero preparata alle concentrazioni desiderate in un terreno di coltura antiparassitaria.
- Includere sempre i seguenti controlli (Figura 3B): un controllo senza controllo delle cellule IEs/THP-1 (terreno di coltura del parassita); un controllo senza alcun anticorpo o plasma/siero (controllo non opsonizzato); un controllo positivo utilizzando l'anticorpo anti-eritrocita umano di coniglio disponibile in commercio a diluizione 1:100 (vedi Tabella dei materiali); due controlli negativi al plasma/siero alla diluizione 1:5 (un pool naïve alla malaria e un pool di maschi esposti alla malaria); e un controllo sierico positivo alla diluizione 1:5 (un pool di donne esposte alla malaria, che sono state precedentemente incinte (preferibilmente multigravidae)).
nota: Una diluizione 1:100 per il controllo positivo sembra funzionare in modo coerente in diversi lotti di anticorpi acquistati (dati non mostrati). Tuttavia, si raccomanda di escludere variazioni tra i lotti testando diverse diluizioni ogni volta che viene utilizzato un nuovo lotto di anticorpi.
- Incubare per 45 minuti al buio a 37 °C.
- Preparazione delle cellule THP-1 e fagocitosi
- Mentre le IE vengono opsonizzate (3.2.8), iniziare a preparare le cellule THP-1.
- Rimuovere le cellule THP-1 dal pallone di coltura, centrifugarle verso il basso (500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente), decantare il surnatante e risospendere il pellet nel terreno di coltura cellulare THP-1.
- Centrifugare nuovamente (500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente), decantare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno di coltura cellulare THP-1.
- Determinare la conta cellulare nella soluzione preparata sopra e aggiungere altro terreno per ottenere una concentrazione finale di 5 x 105 cellule/mL.
- Rimuovere la soluzione bloccante dalla restante piastra a 96 pozzetti (piastra per fagocitosi) muovendo la piastra e rimuovendo il liquido in eccesso su un pezzo di carta assorbente.
- Aggiungere 100 μl per pozzetto della sospensione cellulare THP-1 preparata al punto 3.3.4 e rimetterla nell'incubatore per colture cellulari (Figura 3C).
- Una volta terminato il tempo di incubazione dell'anticorpo/plasma/siero, aggiungere 170 μl per pozzetto di terreno di coltura del parassita. Centrifugare la piastra a 500 x g per 3 minuti a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante facendo scorrere la piastra su un apposito contenitore per rifiuti.
- Lavare gli IE opsonizzati altre due volte utilizzando 200 μl per pozzetto di terreno di coltura parassita, ruotando la piastra a 500 x g per 3 minuti a temperatura ambiente. Il surnatante del primo lavaggio può essere rimosso muovendo la piastra. Rimuovere con cautela il surnatante dal secondo lavaggio, utilizzando una pipetta multicanale per assicurarsi che l'intero volume del mezzo di lavaggio sia stato rimosso. Non disturbare il pellet.
- Infine, risospendere gli IE opsonizzati in 100 μL di terreno di coltura cellulare THP-1 preriscaldato. Trasferire 50 μL di sospensione di IE opsonizzato in ciascun pozzetto della piastra di fagocitosi. Poiché vi è un totale di 100 μL di IE, ogni diluizione di anticorpi/siero può essere eseguita in duplicati nella piastra di fagocitosi (Figura 3D)
nota: La quantità di cellule IE e THP-1 utilizzate nel test corrisponde a un rapporto di 10:1.
- Incubare per 40 minuti al buio a 37 °C, 5% di anidride carbonica (CO2).
nota: Non lasciare che la fagocitosi proceda per più di 40 minuti.
- Arrestare la fagocitosi mediante centrifugazione a 4 °C (500 x g, 5 min) ed eliminare il surnatante agitando la piastra. Aggiungere 150 μl di soluzione lisana di cloruro di ammonio a temperatura ambiente (Tabella dei materiali) e miscelare mediante pipettaggio, incubare per esattamente 3 min.
nota: Questo passaggio liserà gli eritrociti che non sono stati fagocitati dalle cellule THP-1.
- Arrestare la lisi aggiungendo 100 μL di FBS ghiacciato al 2% in PBS. Centrifugare la piastra a 4 °C (500 x g per 3 minuti) e rimuovere il surnatante agitando la piastra su un contenitore di scarto appropriato.
- Lavare tre volte utilizzando 200 μl per pozzetto di FBS ghiacciato al 2% in PBS ruotando la piastra a 4°C (500 x g per 3 min). Dopo il lavaggio finale, risospendere in 200 μL di FBS ghiacciato al 2% in PBS e analizzare immediatamente mediante citometria a flusso.
nota: Pubblicazioni precedenti hanno utilizzato la fissazione cellulare in paraformaldeide al 2% prima della citometria a flusso31, ma i risultati qui presentati sono stati acquisiti immediatamente dopo il completamento del saggio. Non è consigliabile posticipare l'acquisizione dei dati della citometria a flusso conservando la piastra a 4°C, poiché la percentuale di cellule EtBr+ THP-1 decade rapidamente (Figura 4).
4. Acquisizione e analisi della citometria a flusso
NOTA: È possibile utilizzare qualsiasi citometro a flusso che supporti il formato di piastra a 96 pozzetti e disponga di laser/filtri appropriati per misurare la fluorescenza EtBr.
- Per l'acquisizione, il gate su cellule THP-1 utilizza un grafico a diffusione lineare diretta (FSC) rispetto a quello a dispersione laterale lineare (SSC) utilizzando i pozzetti in cui non sono stati aggiunti IE (Figura 2A) e acquisisce 10.000 eventi su questo cancello.
- Misurare l'intensità della fluorescenza per EtBr (FL3-Log) sul gate THP-1 utilizzando un grafico a istogramma.
- Per il gating, il primo gate sulle cellule THP-1 in un grafico di densità FSC vs. SSC, utilizzando i pozzetti in cui non sono stati aggiunti IE (Figura 5A). Quindi impostare un gate positivo in un istogramma FL3 (EtBr), utilizzando le cellule THP-1 (senza IE aggiunte) e il controllo non opsonizzato (Figura 5B).
- Copiare questi gate in tutti gli altri campioni testati nella stessa piastra e determinare la percentuale di cellule THP-1 EtBr-positive (cellule THP-1 che hanno fagocitato almeno un IE). Per ciascuno dei campioni testati, la fagocitosi può essere riportata come valori assoluti (percentuale di cellule EtBr+ THP-1) o come fagocitosi relativa calcolata come percentuale utilizzando il controllo positivo come massimo.
