NOTA: I seguenti protocolli descrivono la preparazione del campione e la quantificazione dell'attività delle neutrofile serina proteasi (NSP). Le procedure sperimentali qui presentate si concentrano sulla misurazione dell'attività dell'espettorato umano e dell'elastasi neutrofila (NE) o della catepsina G (CG). Tuttavia, lievi adattamenti nel protocollo di preparazione del campione rendono possibile l'analisi di cellule derivate dal sangue e omogeneizzati tumorali. Inoltre, le attività della metalloproteinasi della matrice e della catepsina S possono essere studiate in modo analogo per mezzo di sonde FRET dedicate
1. Preparazione del campione: isolamento cellulare e separazione del surnatante
NOTA: Se possibile, il trattamento dell'espettorato dovrebbe essere effettuato entro 120 minuti dall'espettorazione e l'espettorato dovrebbe essere conservato sul ghiaccio fino a nuova lavorazione.
- Se l'espettorazione spontanea dell'espettorato non è possibile, indurre l'espettorato come descritto in precedenza. Brevemente, inalare 200 μg di salbutamolo, antagonista del recettore β-2, prima di iniziare la procedura di induzione dell'espettorato. Successivamente, inalare una soluzione salina ipertonica (6%) per 15 minuti utilizzando un nebulizzatore. Raccogli l'espettorato in una capsula di Petri.
- Separare i grumi di muco dalla saliva in una capsula di Petri con l'aiuto di una punta di pipetta.
- Pesare il muco.
nota: Il peso medio di un campione di muco è di 0,8 g (variabile tra 0,1 g e 5 g); 0,1 g è solitamente sufficiente per eseguire le procedure menzionate.
- Aggiungere 4 parti (v/p) di spuolisina al 10% (in PBS) all'espettorato (ad esempio, 4 ml di spuolisina al 10% per ogni grammo di espettorato).
cautela: La sputalisina è composta da ditiotreitolo concentrato in tampone fosfato, quindi maneggiarla con cura.
- Incubare la miscela a temperatura ambiente (RT) su uno shaker a dondolo per 15 minuti per sciogliere il muco. Per motivi di sicurezza, posizionare l'agitatore in una cappa aspirante.
- Estinguere la reazione aggiungendo lo stesso volume di PBS freddo (ad esempio: 1 mL di PBS freddo per ogni mL di Sputolisina al 10%).
- Miscelare mediante pipettaggio per ottenere una soluzione omogenea.
- Filtrare la miscela attraverso un colino cellulare di nylon da 100 μm in una provetta da 50 mL.
- Ripetere la fase di filtrazione attraverso un filtro a celle di nylon da 40 μm.
- Centrifugare la soluzione per 10 minuti a 300 x g a 4 °C.
- Trasferire con cura la frazione surnatante in un tubo nuovo e conservarla con ghiaccio.
nota: Le frazioni surnatanti possono essere conservate a -20 °C o -80 °C fino a ulteriori analisi.
- Risospendere delicatamente il pellet della cella in 500 μL di PBS freddo e posizionarlo sul ghiaccio.
nota: La frazione cellulare deve essere lavorata immediatamente.
2. Misurazione dell'attività della serina proteasi neutrofila
NOTA: Qui, vengono introdotti diversi metodi per quantificare l'attività di NSP per mezzo di reporter FRET. La scelta della tecnologia è dettata dalla specifica domanda biomedica e dallo scopo dell'esperimento. Le sonde presentate sono state ampiamente testate per la loro specificità rispetto a una serie di enzimi polmonari rilevanti. Sebbene le sonde siano specifiche per il loro enzima target, controllare sempre la specificità della sonda sul campione clinico di interesse. Ciò può essere ottenuto incubando il campione con uno specifico inibitore della proteasi prima dell'aggiunta della sonda, che dovrebbe abolire qualsiasi aumento del rapporto donatore/accettore (D/A).
- Quantificazione dell'attività dell'NSP solubile tramite fluorimetro o lettore di piastre
nota: L'attività della proteasi nelle frazioni solubili del campione può essere rilevata con qualsiasi strumento in grado di rilevare la fluorescenza.
- Scongelare gli enzimi sul ghiaccio.
- Fino all'uso, conservare NE e CG in un tampone acido (50 mM di acetato di sodio, 200 mM di NaCl, pH 5,5) per evitare l'autoscissione.
- Per impostare una curva standard dell'enzima, preparare una diluizione seriale 1:2 dell'enzima (33,9 - 0,271 nM per NE; 42,6 - 0,333 nM per CG) in tampone di attivazione (10 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl a pH 7,5). Il tampone di attivazione ha un pH neutro e quindi consente la catalisi enzimatica in modo efficiente.
- Per preparare la concentrazione standard più alta (concentrazione di NE: 33,9 nM), diluire 1 μL di NE (33,9 μM) in 999 μL di tampone di attivazione.
- Per preparare il secondo standard (concentrazione di NE: 16,95 nM), miscelare 200 μl della prima diluizione con 200 μl di tampone di attivazione.
- Procedere di conseguenza per preparare le restanti diluizioni 1:2.
- L'ultimo standard, che è il grezzo, è composto da un buffer di attivazione puro. Si consiglia la misurazione di duplicati tecnici o triplicati. Durante la preparazione dello standard e del campione, cercare di mantenere le fiale sul ghiaccio.
- Parallelamente alla preparazione standard, diluire i campioni di espettorato in un tampone di attivazione. Diluire i campioni umani prima di valutare la loro attività proteasica per rimanere nell'intervallo lineare di aumento del segnale reporter (rapporto D/A). Se i campioni dei pazienti non fossero stati diluiti, la scissione sarebbe avvenuta troppo rapidamente per un adattamento affidabile. Poiché l'espettorato sano del donatore contiene meno proteasi attive rispetto ai campioni di pazienti con fibrosi cistica (FC) e broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO), vengono generalmente eseguite diverse diluizioni (1:10 per il surnatante dell'espettorato sano, 1:20-500 per il surnatante dell'espettorato dei pazienti con BPCO o FC).
nota: Per misurare quantitativamente l'attività della proteasi in campioni la cui concentrazione è sconosciuta, è necessario misurare in parallelo una curva standard con concentrazioni enzimatiche note, idealmente sulla stessa piastra. La concentrazione dell'enzima attivo nell'espettorato umano viene calcolata interpolando le pendenze misurate nei campioni di espettorato umano con quelle misurate con le curve standard.
- Prima di preparare i campioni per la misurazione, impostare lo strumento. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione per la sonda FRET (Resonance Energy Transfer-Based) NE Förster (NEmo-1) su 354 nm e impostare la lunghezza d'onda di rilevamento su 400 nm per il donatore e 490 nm per l'accettore. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione per la sonda CG FRET (sSAM) su 405 nm e impostare l'emissione su 485 (donatore) e 580 nm (accettore).
- Aggiungere 40 μl di campioni, standard o bianchi, nei pozzetti di una piastra nera a 96 pozzetti.
- Per preparare la master mix contenente i reporter (concentrazione del reporter nella master mix: 10 μM), diluire il fondo sonda (1 mM in dimetilsolfossido, DMSO) 1:100 in tampone di attivazione. Preparare il volume di miscelazione master necessario moltiplicando 10 μl x il numero di pozzetti della piastra richiesti. Per raggiungere la concentrazione finale ottimale (2 μM) per la misura della fluorescenza dei reporter NEmo-1 e sSAM, aggiungere 10 μl della miscela master a ciascun pozzetto (contenente 40 μl di campione, standard o bianco) e avviare la lettura. I reporter NEmo-1 e sSAM monitoreranno quindi l'attività solubile dell'elastasi dei neutrofili e della catepsina G, rispettivamente.
nota: Se non è disponibile un iniettore di reagente, assicurarsi di avviare la lettura il prima possibile dopo l'aggiunta del reporter ai campioni.
- Avviare la misurazione del lettore di piastre e registrare l'aumento del rapporto D/A ogni 60-90 secondi per almeno 20 minuti o fino a quando l'aumento del segnale non raggiunge un plateau.
- Una volta esportati i dati, calcolare il rapporto D/A dividendo le unità di fluorescenza relative (RFU) del donatore con le RFU accettori per ogni punto temporale e campione.
- Calcolare il rapporto D/A, la media e la deviazione standard di ciascun campione.
- Determinare la pendenza all'interno della crescita lineare della variazione del rapporto D/A. La pendenza è un indicatore della velocità di scissione enzimatica per una sonda FRET. Calcolare la concentrazione dell'enzima attivo nell'espettorato adattando le pendenze di regressione lineare derivate dai campioni umani con quelle calcolate dallo standard enzimatico.
