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Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Preparazione del dispositivo microfluidico.
- Preparazione del saggio di migrazione cellulare microfluidica
- Preparare 50 μg/mL di soluzione di fibronectina diluendo 50 μL di soluzione madre di fibronectina (1 mg/mL) in 950 μL di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) all'interno di una cappa di biosicurezza.
- Preparare il terreno di migrazione mescolando 9 ml di terreno del Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) e 1 ml di RPMI-1640 con albumina sierica bovina (BSA) al 4%.
- Rimuovere l'acqua deionizzata dal dispositivo.
- Aggiungere 100 μL di soluzione di fibronectina al dispositivo dalla presa. Attendere 3 minuti per assicurarsi che tutti i canali siano riempiti con una soluzione di fibronectina. Posizionare il dispositivo microfluidico in una capsula di Petri coperta per 1 ora a temperatura ambiente.
- Rimuovere la soluzione di fibronectina dal dispositivo. Aggiungere 100 μl di terreno di migrazione dall'uscita. Attendere 3 minuti per assicurarsi che tutti i canali siano riempiti con il mezzo di migrazione.
- Incubare il dispositivo per un'altra 1 ora a temperatura ambiente; il dispositivo è quindi pronto per l'esperimento di chemiotassi.
- Preparazione della soluzione chemioattrattiva per l'esperimento di chemiotassi.
- Preparare una soluzione fMLP da 100 nM in un totale di 1 mL di terreno di migrazione. Miscelare 5 μL di FITC-destrano madre (10 kDa, 1 mM) con la soluzione fMLP in una provetta da 1,5 mL.
nota: FITC-destrano viene utilizzato per la misurazione del gradiente. In alternativa, utilizzare la rodamina come indicatore del gradiente. La soluzione chemioattrattiva fMLP è quindi pronta per l'esperimento di chemiotassi.
- Preparazione del campione di espettorato.
nota: La chemiotassi dei neutrofili indotta da un gradiente di campioni di espettorato da pazienti con BPCO è stata testata come applicazione diagnostica clinica di questo metodo all-on-chip.
- Ottenere un protocollo di etica umana per raccogliere campioni di espettorato da pazienti con BPCO.
nota: Abbiamo ottenuto le approvazioni per la raccolta di campioni presso il Seven Oaks General Hospital di Winnipeg (approvate dall'Università di Manitoba).
- Ottenere i moduli di consenso scritto informato da tutti i soggetti.
- Raccogliere campioni di espettorato spontaneo dei pazienti con BPCO. Mettere un campione di espettorato da 500 μL in una provetta da 1,5 mL.
- Aggiungere 500 μl di ditiotreitolo allo 0,1% nella provetta da 1,5 mL e mescolare delicatamente. Mettere la provetta a bagnomaria a 37 °C per 15 minuti.
- Centrifugare il campione a 753 x g per 10 minuti e quindi raccogliere il surnatante. Centrifugare il surnatante a 865 x g per 5 minuti e poi raccogliere il surnatante finale. Conservare il surnatante raccolto all'interno di un congelatore a -80 °C prima dell'uso.
- Quando si è pronti per l'esperimento di chemiotassi, scongelare la soluzione di espettorato; trasferire 900 μL di terreno di migrazione in una provetta da 1,5 mL e mescolare con 100 μL di soluzione di espettorato all'interno di una cabina di biosicurezza; la soluzione di espettorato è quindi pronta per l'esperimento di chemiotassi.
- Raccolta di campioni di sangue.
- Ottieni un protocollo di etica umana per raccogliere campioni di sangue da donatori sani. Ottenere i moduli di consenso scritto informato da tutti i donatori di sangue.
nota: Qui i campioni sono stati ottenuti presso il Victoria General Hospital di Winnipeg (approvato dal Joint-Faculty Research Ethics Board dell'Università di Manitoba).
- Raccogliere il campione di sangue mediante puntura venosa e metterlo in una provetta rivestita di EDTA. Conservare la provetta in una cabina di biosicurezza prima dell'esperimento.
2. Operazione di test di chemiotassi all-on-chip
- Isolamento delle celle su chip (Figura 1B).
- Mettere 10 μL di sangue intero in una provetta da 1,5 mL all'interno di una cappa di biosicurezza.
nota: I dettagli sulla raccolta dei campioni di sangue sono riportati nel paragrafo 1.4.
- Aggiungere 2 μL di cocktail di anticorpi (Ab) e 2 μL di particelle magnetiche (MP) dal kit di isolamento dei neutrofili (vedere la tabella dei materiali) nella provetta da 1,5 mL e mescolare delicatamente; questo etichetterà le cellule nel sangue ad eccezione dei neutrofili.
- Incubare la miscela sangue-Ab-MP per 5 minuti a temperatura ambiente.
nota: Questo etichetterà magneticamente le cellule marcate con anticorpi nel sangue.
- Collegare due piccoli dischi magnetici ai due lati della porta di caricamento della cella del dispositivo. Aspirare il fluido da tutte le porte del dispositivo.
- Pipettare lentamente 2 μL di miscela di sangue-Ab-MP nel dispositivo microfluidico dalla porta di caricamento cellulare.
NOTA: Le cellule marcate magneticamente sono intrappolate sulle pareti laterali della porta di caricamento delle cellule, mentre i neutrofili fluiscono nel dispositivo e rimangono intrappolati nella struttura di aggancio delle cellule.
- Attendere qualche minuto fino a quando un numero sufficiente di neutrofili è intrappolato nell'area di aggancio delle cellule.
3. Saggio della chemiotassi (Figura 1C).
- Posizionare il dispositivo microfluidico sul tavolino del microscopio a temperatura controllata a 37 °C.
- Aggiungere 100 μL di soluzione chemioattrattiva (fMLP o soluzione di espettorato) e 100 μL di terreno di migrazione ai serbatoi di ingresso designati utilizzando due pipettatori; questo genererà un gradiente chemioattrattivo nel canale del gradiente mediante miscelazione chimica continua basata sul flusso laminare assistita da una struttura di bilanciamento della pressione><.
nota: I dettagli sulla raccolta dell'espettorato dai pazienti con BPCO sono riportati nel paragrafo 1.3.
- Per l'esperimento di controllo del mezzo, aggiungere solo il mezzo di migrazione a entrambi i serbatoi di ingresso.
- Acquisire l'immagine a fluorescenza di FITC-destrano nel canale del gradiente.
- Importare l'immagine nel software ImageJ utilizzando il comando "File|Apri".
- Misurare il profilo di intensità della fluorescenza attraverso il canale del gradiente utilizzando il comando "Analizza|Profilo della trama".
- Esporta i dati di misurazione in un foglio di calcolo per ulteriori tracciature.
- Incubare il dispositivo sul tavolino del microscopio a temperatura controllata o in un incubatore per colture cellulari convenzionale per 15 minuti.
- Immagine del canale di gradiente utilizzando un obiettivo 10X per registrare le posizioni finali delle celle per l'analisi dei dati.
- Se necessario, registrare la migrazione cellulare nel dispositivo mediante microscopia time-lapse.
4. Analisi dei dati sulla migrazione cellulare (Figura 1C)
- Analizzare il test della chemiotassi calcolando la distanza di migrazione cellulare dalla struttura di docking come descritto di seguito. Vedere la Figura 1C.
- Importare l'immagine nel software NIH ImageJ (ver. 1.45).
- Selezionate il centro di ogni cella che si è spostata nel canale della sfumatura.
- Misura le coordinate delle celle selezionate per le loro posizioni finali. Misurare la coordinata di un punto sul bordo della struttura di ancoraggio come posizione di riferimento iniziale.
- Esporta i dati delle coordinate misurate in un software per fogli di calcolo (ad es. Excel). Calcola la distanza di migrazione delle celle come la differenza tra la posizione finale di una cella e la posizione di riferimento iniziale lungo la direzione del gradiente.
- Calibrare la distanza in un micrometro. Calcola la media e la deviazione della distanza di migrazione di tutte le cellule come misura della chemiotassi.
- Confrontare la distanza di migrazione in presenza di un gradiente chemioattrattivo con l'esperimento di controllo del mezzo utilizzando il test t di Student.
- Se vengono registrate le immagini time-lapse della migrazione cellulare, la migrazione cellulare e la chemiotassi possono essere ulteriormente analizzate mediante l'analisi del tracciamento cellulare.
nota: I materiali necessari per costruire ed eseguire il test di chemiotassi all-on-chip sono descritti in dettaglio nella tabella dei materiali.
