1. Preparazione di cellule bersaglio che esprimono la proteina fluorescente rossa nei loro nuclei
- Ottenere una linea cellulare di cancro di topo bersaglio da una fonte appropriata.
nota: In questo protocollo, viene utilizzato un derivato altamente metastatico delle cellule tumorali mammarie di topo E0771 (E0771-LG). Le cellule E0771 parentali provengono da topi C57BL/6.
- Scongelare e mantenere una fiala di cellule E0771-LG con il Modified Eagles Medium (DMEM) di Dulbecco, incluso il 10% (v/v) di siero fetale bovino (FBS) in un incubatore per colture cellulari a 37 °C, 95% di umidità e 5% di CO2,
nota: Dovrebbe essere confermato che le cellule sono negative per il micoplasma. A tal fine, coltivare cellule E0771 (o cellule da testare) per 2-3 giorni come descritto sopra (in assenza di antibiotici e antimicotici) e raccogliere 500 μL di terreno di coltura. Centrifugare il terreno a 12.419 x g per 60 s per eliminare i detriti cellulari e trasferire il surnatante in nuove provette. Determinare la contaminazione da micoplasma utilizzando un kit per il test del micoplasma disponibile in commercio (fare riferimento alla Tabella dei materiali) e/o la PCR seguendo le istruzioni del produttore.
- Seminare 5 x 103 cellule E0771-LG per pozzetto in una piastra a 12 pozzetti e coltivare le cellule con FBS-DMEM al 10% (v/v) per una notte in un incubatore a 37 °C, 95% di umidità e 5% di CO2,
nota: Se il tasso di proliferazione delle cellule bersaglio è basso (tempo di raddoppio della popolazione superiore a 36 ore), il numero di cellule può essere aumentato a 1 x 104.
- Sostituire il terreno con 1 mL di FBS-DMEM al 10% (v/v) di cui 10 μg/mL di polibrene e aggiungere 25 μL di particelle lentivirali (1 x 106 TU/mL) che codificano per una proteina fluorescente rossa con restrizione nucleare (mKate2, fare riferimento alla Tabella dei materiali).
- Coltura delle cellule per 24 ore in un incubatore a 37 °C, 95% di umidità e 5% di CO2.
- Sostituire il terreno con FBS-DMEM al 10% (v/v) e coltivare le cellule per 24-48 ore in un incubatore a 37 °C, 95% di umidità e 5% di CO2.
- Sostituire il terreno con FBS-DMEM al 10% (v/v) di cui 1 μg/mL di puromicina quando le cellule iniziano a esprimere una proteina fluorescente rossa e coltivare le cellule fino a quando non sono con>nota: La concentrazione di puromicina sarà diversa tra i tipi di cellule bersaglio e dovrebbe essere ottimizzata utilizzando cellule non trasfettate.
- Subcoltura delle cellule sopravvissute per 1-3 passaggi con FBS-DMEM al 10% (v/v) di cui 1 μg/mL di puromicina e crioconservazione in un sistema di stoccaggio in fase di vapore di azoto liquido fino all'uso.
2. Isolamento delle cellule soppressori dai tumori nei topi
NOTA: In questo protocollo, le cellule soppressori (cioè i macrofagi associati alle metastasi (MAM) e le cellule soppressori di derivazione mieloide monocitica (M-MDSC)) sono isolate dal polmone contenente tumori metastatici stabiliti dalle cellule E0771-LG. Le condizioni per la dissociazione tissutale e lo smistamento cellulare dovrebbero essere ottimizzate per isolare le cellule da tessuti diversi.
- Iniettare 1 x 106 cellule tumorali (E0771-LG) nella vena caudale di topi singenici (C57BL/6), femmine, di 7-10 settimane.
- Dopo 14 giorni, isolare il polmone contenente tumori metastatici e preparare sospensioni unicellulari dai polmoni perfusi tramite digestione enzimatica come precedentemente descritto.
nota: In questo protocollo, a quattro topi vengono iniettate cellule tumorali e i loro polmoni metastatici vengono combinati per ottenere un numero sufficiente di cellule soppressori.
- Incubare le sospensioni a singola cellula con anticorpi anti-topo CD16/CD32 per 30 minuti su ghiaccio e colorate con anticorpi fluorescenti contro CD45, F4/80, CD11b, Ly6C e Ly6G (fare riferimento alla Tabella dei materiali) per altri 30 minuti.
- Lavare una volta le cellule colorate con 1 mL di PBS contenente il 2% (p/v) di albumina sierica bovina (BSA) e risospendere il pellet cellulare con 500-1000 μL di PBS contenente il 2% (p/v) di BSA.
- Aggiungere 3 μM di DAPI e selezionare M-MDSC (DAPI–CD45+F4/80+Ly6G–CD11balto, Ly6Calto) e MAM (DAPI–CD45+F4/80+Ly6G–CD11balto, Ly6Cbasso) utilizzando un selezionatore di celle (Figura 1).
nota: La soglia del livello di Ly6C per distinguere i MAM (Ly6Clow) e gli M-MDSC (Ly6Chigh) si basa su quella dei macrofagi alveolari residenti (RMAC). La purezza delle cellule selezionate viene misurata tramite citometria a flusso con una purezza prevista superiore al 90%.
- Risospendere le cellule selezionate con 400 μL di DMEM contenente il 20% (v/v) di FBS, l'1% (v/v) di penicillina/streptomicina, 2 mM di L-glutammina, l'1% (v/v) di amminoacido non essenziale, 1 mM di piruvato di sodio e 50 nM di 2-mercaptoetanolo (chiamato DMEM ARRICCHITO, E-DMEM).
- Contare il numero di cellule vive utilizzando il metodo di esclusione del blu di tripano e regolare a 2 x 106 cellule/mL con E-DMEM.
- Conservare le celle sul ghiaccio fino al momento dell'uso.
3. Isolamento delle cellule T CD8+ dalla milza dei topi
- Isolare la milza da un topo che è singeneico alla linea cellulare tumorale bersaglio (cioè topi C57BL/6 in questo protocollo) come segue:
- Eutanasia dell'animale per inalazione di CO2.
- Posizionare l'animale su una tavola di dissezione pulita e pulire la pelle con etanolo al 70% (v/v).
- Tagliare la pelle addominale usando le forbici per esporre la milza
- Isolare la milza, che si trova nella parte inferiore dello stomaco, e metterla in una provetta contenente 5 ml di PBS ghiacciato.
- Utilizzando lo stantuffo interno di una siringa sterile da 5 ml, macinare la milza su un colino cellulare da 100 μm montato su una provetta da 50 ml.
- Far passare le cellule attraverso il filtro utilizzando un totale di 10 mL di PBS.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 337 x g per 5 minuti e aspirare il surnatante.
- Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di PBS contenente 2 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e 0,5% (p/v) di BSA (tampone di funzionamento) e filtrare attraverso un filtro cellulare da 40 μm.
- Contare il numero di cellule vive e regolare a 1 x 108 cellule/mL utilizzando il buffer in esecuzione.
nota: Conservare una piccola aliquota di cellule come campione di pre-arricchimento per un controllo della purezza.
- Arricchire le cellule T CD8+ utilizzando un kit di selezione negativa e un selezionatore magnetico (fare riferimento alla Tabella dei Materiali).
- Trasferire 1 x 108 (1 mL) delle cellule splenocitarie in una provetta di polistirene a fondo tondo da 5 mL.
- Aggiungere 50 μl di anticorpi biotinilati e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.
- Aggiungere 125 μl di microsfere magnetiche coniugate con streptavidina e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
- Aggiungere 1,325 mL di tampone scorrevole e miscelare delicatamente mediante pipettaggio.
- Posizionare la provetta nel magnete e incubare a temperatura ambiente per 2,5 minuti.
- Raccogli il magnete e versa la sospensione cellulare arricchita in un nuovo tubo.
- Risospendere le cellule arricchite con 200 μL di E-DMEM (cioè DMEM contenente il 20% (v/v) di FBS, l'1% (v/v) di penicillina/streptomicina, 2 mM di L-glutammina, l'1% (v/v) di amminoacido non essenziale, 1 mM di piruvato di sodio e 50 nM di 2-mercaptoetanolo).
- Contare il numero di cellule vive e regolare a 2 x 106 cellule/mL con E-DMEM. Conservare le celle a 37 °C in un incubatore di CO2 fino all'uso.
nota: Conservare una piccola aliquota di cellule come campione post-arricchimento per un controllo di purezza.
- Determinare la purezza delle cellule T CD8+ mediante citometria a flusso come segue:
- Prelevare 1 x 104 cellule da campioni di pre-arricchimento (fase 3.6) o post-arricchimento (fase 3.9) e regolare il volume totale di ciascuna a 100 μl utilizzando un tampone in esecuzione.
- Incubare le sospensioni a singola cellula con anticorpi anti-topo CD16/CD32 per 30 minuti su ghiaccio e colorare con anticorpi fluorescenti contro CD45, CD3, CD4 e CD8 (fare riferimento alla Tabella dei materiali) per altri 30 minuti.
- Lavare le celle colorate con 500 μL di PBS contenente il 2% (p/v) di BSA e risospendere il pellet cellulare con 500-1000 μL di PBS contenente il 2% (p/v) di BSA.
- Aggiungere 3 μM di 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e determinare la percentuale di cellule CD3+CD4–CD8+ nella popolazione totale di cellule CD45+.
4. Attivazione ed espansione delle cellule T CD8+ isolate
- Aliquotare 1 x 105 cellule per 50 μL di cellule T CD8+ (preparate al punto 3.9) nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti con fondo a U.
- Aggiungere 1 x 105 cellule per 50 μL di cellule soppressori (preparate al punto 2.7) o 50 μL di E-DMEM nei pozzetti.
- Preparare il terreno di attivazione costituito da E-DMEM, 4 x 104 U/mL fattore stimolante le colonie 1 (CSF-1), 240 U/mL di interleuchina-2 (IL-2), 8 μg/mL di anticorpo CD3ε anti-topo e 16 μg/mL di anticorpo CD28 anti-topo.
nota: Il CSF-1 non è necessario per l'attivazione delle cellule T, ma è essenziale per la sopravvivenza delle cellule soppressori in questo protocollo (ad esempio, MAM e M-MDSC). Pertanto, viene trattenuto nella co-coltura di cellule T con cellule tumorali bersaglio per mantenere la coerenza nelle condizioni di coltura. Poiché il CSF-1 si trova in concentrazioni nano-molari in tutti i tessuti ed è necessario per la vitalità di monociti/macrofagi in vivo, questo è un contesto fisiologico per queste cellule.
- Aggiungere 50 μL di terreno di attivazione (passaggio 4.3) e 50 μL di E-DMEM con o senza reagenti da testare.
- Posizionare la piastra in un incubatore a 37 °C, 95% di umidità e 5% di CO2 e coltivare le cellule per 4 giorni.
5. Impostazione della co-coltura di cellule bersaglio con cellule T CD8+ pre-attivate
- Aggiungere 30 μl di matrice di membrana basale solubile diluita 1:100 a ridotto fattore di crescita diluito (Tabella dei materiali) nei pozzetti di una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti adatta per la microscopia e incubare a 37 °C in un incubatore di CO2 per almeno 1 ora.
- Preparare le cellule bersaglio (ad esempio, le cellule E0771-LG che esprimono la proteina fluorescente rossa con restrizione nucleare).
- Incubare le cellule bersaglio con 1 mL di tripsina/EDTA allo 0,05% a temperatura ambiente per 1 minuto e raccogliere le cellule mediante pipettaggio delicato.
- Aggiungere 9 mL di DMEM, di cui il 10% (v/v) di FBS, e centrifugare la sospensione cellulare a 337 x g per 5 minuti.
- Risospendere le cellule con 500 μL di E-DMEM e contare il numero di cellule vive.
nota: Prima di contare le cellule bersaglio, filtrare le cellule attraverso un filtro cellulare da 40 μm per produrre una sospensione a cellula singola.
- Regolare la densità a 2 x 104 cellule/mL (= 1 x 103 cellule per 50 μL) aggiungendo E-DMEM e mantenere le cellule sul ghiaccio.
- Preparare le cellule effettrici (cioè le cellule T CD8+ preattivate).
- Risospendere accuratamente le cellule in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti (passaggio 4.5) mediante pipettaggio e trasferire le cellule T CD8+ galleggianti in una nuova provetta da 1,5 mL.
nota: I MAM e gli M-MDSC aderiscono saldamente al pozzetto e non vengono staccati dal pipettaggio.
- Per raccogliere le cellule rimanenti, aggiungere 200 μl di PBS nel pozzetto e trasferirlo nella provetta nel passaggio 5.3.1.
- Lavare una volta le cellule con 1 mL di E-DMEM (centrifugare a 337 x g) per 5 minuti, aspirare e scartare il surnatante) e risospenderle con 100 μL di E-DMEM.
- Contare il numero di cellule vive (utilizzando il metodo di esclusione del blu di tripano), regolare la densità a 1,6 x 105 cellule/mL (= 4 x 103 cellule/25 μL) e mantenere le cellule sul ghiaccio.
- Aspirare la matrice della membrana basale da ciascun pozzetto della piastra nel passaggio 5.1.
- Aggiungere 1 x 103 cellule/50 μL di cellule bersaglio (passaggio 5.2.4) in ciascun pozzetto e mescolare bene.
nota: Per evitare effetti sui bordi dovuti all'evaporazione del fluido, per l'analisi devono essere utilizzati solo i 60 pozzetti interni della piastra a 96 pozzetti.
- Aggiungere 25 μL di E-DMEM, inclusi 4 x 10,3 U/mL di IL-2 e 10 μM di substrato di caspasi-3 fluorogenica (fare riferimento alla Tabella dei materiali).
- Aggiungere 4 x 103 cellule/25 μL di cellule T CD8+ (passaggio 5.3.4) in pozzetti appropriati e mescolare bene.
nota: La presenza di troppe cellule in un pozzetto rende l'analisi più difficile. In questo modello, un rapporto effettore/target 4:1 (numero totale di celle 5 x 103 cellule/pozzetto) era ottimale, ma un rapporto 8:1 era subottimale. Per facilitare l'analisi dei dati, sono necessari pozzetti contenenti i seguenti quattro controlli: cellule bersaglio alla densità utilizzata per i pozzetti di co-coltura (1 x 103 cellule/pozzetto) in terreno con e senza substrato di caspasi-3, cellule effettrici (1 x 103 cellule/pozzetto) in terreno con e senza substrato di caspasi-3.
- Aggiungere 200 μL di PBS o acqua sterile in tutti i pozzetti vuoti (in particolare i pozzetti alla periferia della piastra) per ridurre l'evaporazione del terreno dai pozzetti sperimentali.
- Inserire la piastra in un microscopio a fluorescenza time-lapse mantenuto a 37 °C, 95% di umidità e 5% di CO2,
nota: Agitare la piastra a croce per distribuire uniformemente tutte le cellule, quindi lasciare che la piastra rimanga a temperatura ambiente su una superficie piana per 10-20 minuti prima di trasferirla nell'incubatore.
6. Imaging delle cellule
NOTA: Le impostazioni dettagliate di acquisizione delle immagini variano a seconda del microscopio e dei fluorofori utilizzati; i seguenti parametri generali di acquisizione dovrebbero essere utilizzati per ottenere risultati ottimali.
- Utilizzando un'appropriata routine di messa a fuoco automatica al microscopio, acquisire immagini che coprano almeno il 25% dell'area superficiale totale in ciascun pozzetto sperimentale della piastra a 96 pozzetti.
- Impostare il microscopio per acquisire immagini in contrasto di fase, nonché un canale fluorescente adatto per la proteina fluorescente rossa a restrizione nucleare (mKate2) e un canale fluorescente adatto per il substrato verde della caspasi-3 attivata fluorogenica (con eccitazione a 488 nm) (Figura 2).
- Acquisire immagini nei pozzetti sperimentali in contrasto di fase e nei 2 canali fluorescenti ogni 1-3 ore per almeno 72 ore.
