Valutazione dell'attivazione di caspasi multiple nei macrofagi

Abstract

Fonte: Han, J. et al., Valutazione dell'attivazione della caspasi per valutare la morte delle cellule immunitarie innate.J. Vis. Exp.(2023)

Questo video dimostra la valutazione delle attivazioni multiple delle caspasi nei macrofagi derivati dal midollo osseo attraverso la stimolazione con il virus dell'influenza. Dopo la lisi dei macrofagi, l'inattivazione termica del lisato e la centrifugazione, le caspasi intracellulari vengono raccolte per la successiva analisi immunologica.

Protocollo

1. Preparare le soluzioni

1. Preparare i terreni condizionati L929.
   1. Piastra 1 × 10⁶ cellule L929 (vedere la Tabella dei materiali) in un pallone di coltura tissutale da 182^cm2 contenente 50 mL di terreni di coltura L929 (vedere la Tabella 1 per la preparazione dei terreni).
   2. Far crescere le cellule in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di anidride carbonica, CO₂.
   3. Dopo 7 giorni, raccogliere il surnatante e filtrare con un filtro da 0,45 μm. Preparare aliquote da 50 ml (conservare le aliquote congelate a -80 °C per un massimo di 1 anno).
2. Preparare 500 mL di terreno di coltura per macrofagi derivati dal midollo osseo (BMDM) (Tabella 1).
3. Preparare 500 ml di terreno di stimolazione BMDM (Tabella 1).
4. Preparare 500 ml di terreno per l'infezione (Tabella 1).
5. Preparare 100 ml di tampone Tris 1 M (Tabella 1).
6. Preparare 4 tamponi di sodio dodecil solfato (SDS) (Tabella 1).
7. Preparare 1 mL di 1 M 1,4-ditiotreitolo (DTT, Tabella 1).
8. Preparare 40 mL di tampone per la lisi della caspasi (Tabella 1).
9. Preparare 100 ml di tampone Tris 1,5 M (Tabella 1).
10. Preparare 100 mL di una soluzione SDS al 10% (wt/vol) (Tabella 1).
11. Preparare 50 mL di tampone per test di radioimmunoprecipitazione (RIPA) 2x (Tabella 1).
12. Preparare una soluzione di lipopolisaccaride da 5 mg/mL, LPS (Tabella 1).
13. Preparare una soluzione di adenosina trifosfato 0,5 M, ATP (Tabella 1).
14. Preparare le soluzioni di western blotting.
    1. Preparare 1 litro di 5 tamponi in corso (Tabella 1).
    2. Preparare 1 litro di 10x buffer di trasferimento (Tabella 1).
    3. Preparare 1 L di soluzione salina tamponata con Tris con Tween 20 (TBST, Tabella 1).
    4. Preparare 100 ml di una soluzione bloccante del latte scremato al 5% (wt/vol) (Tabella 1).
15. Preparare le soluzioni anticorpali primarie.
    1. Preparare 10 mL di anticorpo primario caspasi-1 (Tabella 1).
    2. Preparare 10 mL di anticorpo primario caspasi-11 (Tabella 1).
    3. Preparare 10 mL di anticorpo primario caspasi-3 (Tabella 1).
    4. Preparare 10 mL di anticorpo primario caspasi-7 (Tabella 1).
    5. Preparare 10 mL di anticorpo primario caspasi-8 (Tabella 1).
    6. Preparare 10 mL di anticorpo primario caspasi-9 (Tabella 1).
    7. Preparare 10 ml di anticorpo primario β-actina coniugato con HRP (Tabella 1).
16. Preparare le soluzioni di anticorpi secondari.
    1. Preparare 10 mL di anticorpo secondario anti-coniglio (Tabella 1).
    2. Preparare 10 mL di anticorpo secondario anti-topo (Tabella 1).
    3. Preparare 10 mL di anticorpo secondario anti-ratto (Tabella 1).

2. Isolamento dei macrofagi derivati dal midollo osseo

NOTA: Per questo protocollo, possono essere utilizzati topi wild-type di 6-10 settimane con percorsi di morte cellulare programmata (PCD) intatti o topi mutanti con regolatori PCD, effettori o molecole di interesse eliminati o alterati.

1. Eutanasia di un topo in una camera di CO₂ con una portata che sposta il 10%-30% del volume della gabbia al minuto per 2-3 minuti. Quindi, eseguire un metodo di eutanasia secondaria, come la lussazione cervicale. Seguire tutte le linee guida e i regolamenti aggiuntivi specifici di strutture, istituti e governi, ove applicabili.
2. Seziona il topo per recuperare le ossa della zampa posteriore.
   1. Appunta il topo sul dorso in modo che l'addome sia esposto. Spruzzare con etanolo al 70% (vol/vol) per sterilizzare le zampe posteriori e l'addome.
      cautela: L'etanolo è infiammabile. Tenerlo lontano da fiamme libere.
   2. Usa le forbici per praticare un'incisione sulla linea mediana dell'addome; continua a tagliare verso le gambe per rendere visibili i femori.
   3. Prendi la zampa posteriore destra e allontana la pelle dal corpo verso la linea mediana. Staccare la gamba dal corpo recidendo i muscoli adduttori verso la linea mediana; Quindi, taglia la gamba tra l'articolazione dell'anca e la colonna vertebrale. Quindi, taglia la zampa distalmente alla caviglia e rimuovi il tessuto in eccesso dall'osso staccando la pelle e usando le forbici leggermente aperte per rimuovere il tessuto del polpaccio.
   4. Posizionare la gamba su un asciugamano imbevuto di etanolo al 70% (vol/vol) e sezionare la tibia e il femore.
      1. Stringi la tibia e il femore ciascuno con una serie separata di pinze. Premere delicatamente la tibia contro la direzione naturale dell'articolazione del ginocchio; Ciò causerà la rottura della tibia al ginocchio.
      2. Se necessario, utilizzare le pinze e le forbici da dissezione per rimuovere il tessuto sospeso rimanente. Conserva la tibia per un uso successivo posizionandola sull'asciugamano imbevuto di etanolo.
      3. Raccogli il femore allo stesso modo, spezzando il ginocchio.
   5. Ripeti i passaggi 3 e 4 sopra per la gamba sinistra per rimuoverla dal corpo e sezionare la tibia e il femore.
   6. Spruzzare le ossa con etanolo al 70% (vol/vol).
   7. Pulisci le ossa mettendole su un asciugamano pulito imbevuto di etanolo al 70% (vol/vol), stringendo la parte carnosa nell'asciugamano e strofinando l'asciugamano contro l'osso per rimuovere il tessuto in eccesso.
3. Una volta che entrambi i femori ed entrambe le tibie sono puliti, spruzzare tutte e quattro le ossa con etanolo al 70% (vol/vol). Raccogliere le ossa in una capsula di Petri sterile e sciacquarle con 10 ml di terreno di coltura BMDM agitando delicatamente il terreno nella piastra.
4. Riempire una siringa da 10 ml con 10 ml di terreno di coltura BMDM fresco e inserire un ago da 25 G.
5. Raccogli la tibia usando una pinza, quindi taglia l'articolazione della caviglia con un angolo di ~45°.
6. Sciacquare il midollo osseo dalla tibia.
   1. Tenere la tibia su una provetta da 50 ml, con l'estremità stretta della tibia rivolta verso il basso. Erogare il terreno sulla tibia dalla siringa piena.
   2. Inserire l'ago (all'inizio delicatamente) all'estremità superiore del midollo ed erogare il terreno.
   3. Rimuovere l'ago e quindi inserirlo di nuovo. Utilizzare pressioni brevi e ad alta pressione per erogare il terreno e spostare l'ago nel midollo.
   4. Una volta che il terreno inizia a fuoriuscire dal fondo dell'osso, utilizzare spinte brevi e ad alta pressione per continuare a lavare le cellule. Monitora il colore dell'osso durante questo processo e, quando l'osso è bianco, scartalo.
   5. Fallo per entrambe le tibie.
7. Ripetere i passaggi 5 e 6 sopra per i femori, tagliando l'articolazione dell'anca come la tibia è stata tagliata all'articolazione della caviglia. Utilizzare la stessa provetta da 50 mL per raccogliere il terreno di coltura BMDM durante il lavaggio del midollo.
8. Una volta che tutte e quattro le ossa sono state lavate, aspirare il midollo e il terreno dalla provetta da 50 mL su e giù 3 volte attraverso un ago da 18 G su una siringa da 10 mL, sciacquando ogni volta i lati della provetta per disperdere il midollo.
9. Regolare il volume finale nella provetta da 50 mL a 30 mL con i terreni di coltura BMDM e assicurarsi che le cellule siano completamente sospese.
10. Utilizzare un filtro cellulare da 70 μm per filtrare i terreni di coltura BMDM dalla provetta da 50 mL.
11. Piastra la sospensione cellulare risultante, che contiene le cellule progenitrici del midollo osseo, in tre piastre di coltura tissutale da 150 mm aggiungendo 10 ml (o ~20 × 10⁶ cellule) a ciascuna. Quindi, aggiungere altri 10 ml di terreno di coltura BMDM a ciascuna piastra. Incubare in un'incubatrice umidificata a 37 °C.

3. Differenziare i BMDM e placcare per gli esperimenti

1. Incubare le cellule progenitrici del midollo osseo piastrate a 37 °C per 3 giorni. Quindi, rimuovere ogni piatto e aggiungere altri 5-8 ml di terreno di coltura BMDM (Tabella 1). Rimettere in incubatrice a 37 °C.
2. Il giorno 5 dopo l'impiattamento iniziale, rimuovere ogni piatto e aggiungere altri 5 ml di terreno di coltura BMDM. Rimettere in incubatrice a 37 °C.
3. Il giorno 6, rimuovi ogni piatto e getta il supporto. Quindi, aggiungere 10 ml di soluzione salina fredda (conservata a 4 °C) tamponata con fosfato (PBS) per lavare una volta. Scartare i 10 ml di lavaggio PBS freddo. Quindi, aggiungi 10 ml di PBS fresco e freddo a ciascun piatto e incuba ogni piatto con ghiaccio per 5 minuti.
4. Utilizzando un raschietto cellulare, raschiare delicatamente le cellule da tutte e tre le piastre in una provetta da 50 ml. Centrifugare delicatamente le celle a 270 × g a 4 °C per 5 min; Quindi, scartare il surnatante.
5. Aggiungere 20 mL di terreno di coltura BMDM, pipettare su e giù per risospendere il pellet e contare le cellule.
   nota: Si prevede che ogni topo produrrà circa 60 × 10 6-100 × 10⁶ cellule.
6. Pianificare il layout della piastra a 12 pozzetti per il test di stimolazione della morte/infiammazione cellulare in vitro desiderato. Pianificare di piastrare 1 × 10⁶ celle per pozzetto. Per ogni stimolazione pianificata, includere almeno tre repliche biologiche e una piastra di pozzetti da raccogliere nel tampone di lisi della caspasi e una seconda serie di pozzetti da raccogliere nel tampone RIPA.
7. Piastra 1 × 10⁶ cellule in 1 mL di terreno di coltura BMDM per pozzetto in piastre da 12 pozzetti. Coltura notturna in incubatore umidificato a 37 °C prima di procedere alla valutazione della morte/infiammazione cellulare. Dopo l'incubazione notturna, rimuovere il terreno e aggiungere 1 mL di PBS caldo (37 °C) a ciascun pozzetto per lavare le cellule.
8. Rimuovere il lavaggio PBS e aggiungere 500 μl di terreno di stimolazione BMDM con antibiotici (se si eseguono stimolazioni non batteriche) o mezzi di stimolazione BMDM senza antibiotici (se si eseguono stimolazioni batteriche) (Tabella 1). Incubare per 2 ore prima di passare alla fase 4 per la stimolazione/infezione in vitro.

4. Stimolare o infettare le cellule

ATTENZIONE: Gli agenti inclusi in questo protocollo sono potenzialmente patogeni e devono essere maneggiati con le dovute precauzioni in una struttura di biosicurezza di livello 2 (BSL2) con l'approvazione delle autorità istituzionali e governative competenti.

1. Stimolare i BMDM ad attivare la morte cellulare con l'innesco di interesse.
   nota: Ai fini di questo protocollo, per l'illustrazione vengono utilizzati il virus dell'influenza A (IAV), il virus dell'herpes simplex 1 (HSV1), la Francisella novicida e l'LPS + ATP, ma possono essere utilizzati altri fattori scatenanti.
   1. Esempio di stimolazione 1: Infettare con IAV (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8]) (costruito secondo Hoffmann et al.; il titolo virale per la determinazione della molteplicità dell'infezione [MOI] è calcolato da un test di placca in cellule MDCK):
      1. Calcolare il volume di virus necessario per l'infezione a una molteplicità di infezioni (MOI) di 20 unità formanti placche (PFU) utilizzando l'equazione (1) e l'equazione (2):
         
         
         
   2. Rimuovere il terreno dai BMDM e lavare le celle una volta con 500 μL di PBS. Aggiungere 450 μL di IAV (20 MOI) in DMEM ad alto contenuto di glucosio senza siero fetale bovino inattivato termicamente, (HI)-FBS in ciascun pozzetto. Incubare le piastre a 37 °C per 1 ora in un'incubatrice umidificata per consentire l'assorbimento.
   3. Rimuovere le piastre e aggiungere 50 μl di HI-FBS. Rimettere le piastre nell'incubatore a 37 °C. Incubare per un totale di 12 ore.

5. Raccolta del surnatante combinato e del lisato proteico da utilizzare per i western blot di caspasi

1. Dopo 4 ore, 12 ore o 16 ore di incubazione (il tempo specifico dipende dal grilletto utilizzato), rimuovere la piastra dall'incubatrice.
2. Rimuovere 150 μl di surnatante; scartarlo o conservarlo per altre analisi del surnatante (ad esempio, saggio di immunoassorbimento enzimatico [ELISA]). Non rimuovere il surnatante rimanente.
3. Creare la soluzione di raccolta delle proteine combinando 50 μL di tampone di lisi della caspasi + 100 μL di tampone SDS 4x per pozzetto (Tabella 1). Quindi, aggiungere 150 μl della miscela a ciascun pozzetto.
4. Per ogni pozzetto, pipettare la miscela su e giù per raccogliere le cellule lisate e il surnatante. Durante il pipettaggio, raschiare anche il fondo del pozzetto con la punta della pipetta per distruggere le cellule. Dopo la raschiatura e il pipettaggio, raccogliere il lisato proteico in provette da 1,5 ml etichettate.
5. Utilizzare un blocco termico per riscaldare tutti i tubi a 100 °C per 12 minuti.
6. Pellettare tutti i componenti insolubili centrifugando a 14.500 × g per 30 s a temperatura ambiente.
   NOTA: Questo è un punto di pausa: le proteine del surnatante combinato e dei lisati proteici possono essere utilizzate immediatamente o conservate a -20 °C per un massimo di 2 mesi o a -80 °C per un massimo di 6 mesi fino al momento dell'uso.

categoria	Reagenti	preparazione	osservazioni	Misure di sicurezza
Media	Terreni di coltura L929	1) Inattivare a caldo FBS (vedi osservazioni). 2) Combinare 43,5 ml di Dulbecco's Medium modificato (IMDM) di Iscove, 5 ml di siero fetale bovino inattivato termicamente (HI-FBS), 0,5 ml di piruvato di sodio, 0,5 ml di aminoacidi non essenziali e 0,5 ml di penicillina e streptomicina.	Inattivare a caldo FBS incubando a 56 °C per 30 min.
	Terreni di coltura di macrofagi derivati dal midollo osseo (BMDM)	Combinare 290 ml di IMDM, 150 ml di terreno condizionato con L929 e 5 ml di aminoacidi non essenziali, 50 ml di HI-FBS e 5 ml di penicillina e streptomicina.	Riscaldare il fluido a 37 °C in un bagno d'acqua o di perline prima dell'uso. I terreni possono essere conservati a 4 °C per un massimo di 1 settimana.
	Mezzi di stimolazione BMDM con antibiotici	Combinare 445 ml di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 50 ml di HI-FBS e 5 ml di penicillina e streptomicina.	Riscaldare il fluido a 37 °C in un bagno d'acqua o di perline prima dell'uso. I terreni possono essere conservati a 4 °C per un massimo di 1 settimana.
	Mezzi di stimolazione BMDM senza antibiotici	Combinare 450 mL di DMEM e 50 mL di HI-FBS.	Riscaldare il fluido a 37 °C in un bagno d'acqua o di perline prima dell'uso. I terreni possono essere conservati a 4 °C per un massimo di 1 settimana.
	Terreno di infezione (no HI-FBS)	Combinare 495 ml di DMEM ad alto contenuto di glucosio con 5 ml di penicillina e streptomicina.	Riscaldare il fluido a 37 °C in un bagno d'acqua o di perline prima dell'uso. I terreni possono essere conservati a 4 °C per un massimo di 1 settimana.
Tampone sodio dodecil solfato (SDS)	1 M Tris buffer (per 4x buffer SDS)	1) Sciogliere 12,11 g di Tris in 80 mL di acqua deionizzata. 2) Regolare il pH a 6,8 aggiungendo gocce di HCl mentre si mescola. 3) Aggiungere acqua deionizzata per regolare il volume finale a 100 ml.	Il tampone può essere conservato a 4 °C per un massimo di 1 mese.	L'HCl è caustico. Indossare sempre adeguati dispositivi di protezione individuale; Ciò includerà un camice da laboratorio e guanti. L'HCl deve essere maneggiato in una cappa aspirante.
	4x buffer SDS	1) Combinare 60 ml di soluzione 1 M Tris (pH 6,8), 24 mg di SDS, 100 mg di blu di bromofenolo, 120 ml di glicerolo, 8,4 ml di β-mercaptoetanolo (BME) e 90 ml di acqua deionizzata. 2) Mescolare su una piastra riscaldante per consentire ai sali di entrare nella soluzione. 3) Aggiungere acqua deionizzata per regolare il volume finale a 300 ml.	Il tampone può essere aliquotato e conservato a -20 °C per un massimo di 1 anno.	La SDS è caustica e il BME è cancerogeno. Indossare sempre adeguati dispositivi di protezione individuale; Ciò includerà un camice da laboratorio e guanti. SDS e BME devono essere maneggiati in una cappa aspirante.
Tampone di lisi della caspasi	1 M 1,4-ditiotreitolo (DTT)	Sciogliere 0,154 g di polvere di DTT in 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Consenti a DTT di entrare nella soluzione.	Il tampone può essere aliquotato in aliquote da 200 μL e conservato a -20 °C per un massimo di 1 anno.
	Tampone di lisi con caspasi	Combinare 35 ml di acqua deionizzata, 4 ml di NP-40, 750 μL di DTT 1 M, 1 compressa di inibitore della proteasi e 1 compressa di inibitore della fosfatasi.	Il tampone può essere conservato a 4 °C per un massimo di 1 mese.
Tampone per il saggio di radioimmunoprecipitazione (RIPA)	1,5 M Tris buffer (per buffer RIPA)	1) Sciogliere 18,2 g di Tris in 80 mL di acqua deionizzata. 2) Regolare il pH a 8,8 aggiungendo gocce di NaOH mescolando. 3) Aggiungere acqua deionizzata per regolare il volume finale a 100 ml.	Il tampone può essere conservato a 4 °C per un massimo di 1 mese.	Il NaOH è corrosivo e può causare ustioni. Indossare sempre adeguati dispositivi di protezione individuale; Ciò includerà un camice da laboratorio e guanti.
	Soluzione SDS al 10% (peso/volume (per buffer RIPA)	1) Aggiungere 10 g di SDS a 80 ml di acqua deionizzata. 2) Mescolare fino a quando non si scioglie. 3) Aggiungere acqua deionizzata per regolare il volume finale a 100 ml.	La soluzione può essere conservata a temperatura ambiente per un massimo di 6 mesi. Se la soluzione precipita, riscaldare delicatamente per riscioglierla.	La SDS è caustica. Indossare sempre adeguati dispositivi di protezione individuale; Ciò includerà un camice da laboratorio e guanti. Le SDS devono essere maneggiate in una cappa aspirante.
	RIPA buffer (2x stock)	1) Combinare 0,5 g di desossicolato di sodio, 1 mL di NP-40, 0,876 g di NaCl, 3,3 mL di 1,5 M Tris (pH 8,8) e 1 mL di SDS al 10% (wt/vol) in 46 mL di acqua deionizzata. 2) Mescolare fino a quando non si scioglie. 3) Aggiungere acqua deionizzata per regolare il volume finale a 50 ml.	2x RIPA stock può essere conservato a 4 °C per un massimo di 1 mese.	La SDS è caustica. Indossare sempre adeguati dispositivi di protezione individuale; Ciò includerà un camice da laboratorio e guanti. Le SDS devono essere maneggiate in una cappa aspirante.
Trigger sterili	Lps	Sciogliere l'LPS liofilizzato di E. coli 0111:B4 in acqua priva di endotossine a una concentrazione di 5 mg/mL.	La soluzione può essere conservata a -20 °C per un massimo di 2 anni.
	0,5 M ATP	Sciogliere 1 g di ATP liofilizzato in 3,63 ml di acqua priva di endotossine.	La soluzione può essere aliquotata e conservata a -20 °C per un massimo di 2 anni.
Soluzioni di Western blotting	Esecuzione di buffer (5x azione)	1) Combinare 15 g di Tris base, 72 g di glicina e 5 g di SDS in 900 ml di acqua deionizzata. 2) Mescolare fino a quando non rimangono particolati. 3) Aggiungere acqua deionizzata per regolare il volume finale a 1 L.	Il tampone può essere conservato a temperatura ambiente per un massimo di 6 mesi.	La SDS è caustica. Indossare sempre adeguati dispositivi di protezione individuale; Ciò includerà un camice da laboratorio e guanti. Le SDS devono essere maneggiate in una cappa aspirante.
	Buffer di trasferimento (10x azione)	1) Combinare 30,3 g di base Tris e 72 g di glicina in 900 ml di acqua deionizzata. 2) Mescolare fino a quando non rimangono particolati. 3) Aggiungere acqua deionizzata per regolare il volume finale a 1 L.	Il tampone può essere conservato a temperatura ambiente per un massimo di 3 mesi.
	Soluzione salina con tampone Tris con Tween 20 (TBST)	1) Sciogliere 2,42 g di Tris base e 8,76 g di NaCl in 850 mL di acqua deionizzata. 2) Regolare il pH a 7,4 aggiungendo gocce di HCl mentre si mescola. 3) Aggiungere acqua deionizzata per regolare il volume finale a 1 L. 4) Aggiungere 0,5 mL di Tween 20 (concentrazione finale dello 0,05% (vol/vol)).	La soluzione può essere conservata a temperatura ambiente per 1 mese.	L'HCl è caustico. Indossare sempre adeguati dispositivi di protezione individuale; Ciò includerà un camice da laboratorio e guanti. L'HCl deve essere maneggiato in una cappa aspirante.
	Soluzione bloccante del latte scremato al 5% (wt/vol)	Sciogliere 5 g di latte scremato in polvere in 100 ml di TBST.	La soluzione può essere conservata a 4 °C per un massimo di 1 settimana.
Anticorpi primari	Anticorpo primario della caspasi-1	Diluire l'anticorpo anti-caspasi-1 1:1.000 (vol/vol) aggiungendo 10 μL di anticorpo a 10 mL di soluzione bloccante del latte scremato al 5% (wt/vol).	Per risultati ottimali, prepara fresco per ogni esperimento. Tuttavia, questa soluzione può essere utilizzata almeno 3 volte senza perdita di efficacia. Conservare a -20 °C in caso di riutilizzo.
	Anticorpo primario della caspasi-11	Diluire l'anticorpo anti-caspasi-11 1:1.000 (vol/vol) aggiungendo 10 μL di anticorpo a 10 mL di soluzione bloccante il latte scremato al 5% (wt/vol).	Per risultati ottimali, prepara fresco per ogni esperimento. Tuttavia, questa soluzione può essere utilizzata almeno 3 volte senza perdita di efficacia. Conservare a -20 °C in caso di riutilizzo.
	Anticorpo primario della caspasi-3	Diluire l'anticorpo anti-caspasi-3 e l'anticorpo anti-caspasi-3 scissa 1:1.000 (vol/vol) aggiungendo 10 μL di ciascun anticorpo agli stessi 10 mL di soluzione bloccante del latte scremato al 5% (wt/vol).	Per risultati ottimali, prepara fresco per ogni esperimento. Tuttavia, questa soluzione può essere utilizzata almeno 3 volte senza perdita di efficacia. Conservare a -20 °C in caso di riutilizzo.
	Anticorpo primario della caspasi-7	Diluire l'anticorpo anti-caspasi-7 e l'anticorpo anti-caspasi-7 scissa 1:1.000 (vol/vol) aggiungendo 10 μL di ciascun anticorpo agli stessi 10 mL di soluzione bloccante del latte scremato al 5% (wt/vol).	Per risultati ottimali, prepara fresco per ogni esperimento. Tuttavia, questa soluzione può essere utilizzata almeno 3 volte senza perdita di efficacia. Conservare a -20 °C in caso di riutilizzo.
	Anticorpo primario caspasi-8	Diluire l'anticorpo anti-caspasi-8 e l'anticorpo anti-caspasi-8 scissa 1:1.000 (vol/vol) aggiungendo 10 μL di ciascun anticorpo agli stessi 10 mL di soluzione bloccante del latte scremato al 5% (wt/vol).	Per risultati ottimali, prepara fresco per ogni esperimento. Tuttavia, questa soluzione può essere utilizzata almeno 3 volte senza perdita di efficacia. Conservare a -20 °C in caso di riutilizzo.
	Anticorpo primario della caspasi-9	Diluire l'anticorpo anti-caspasi-9 1:1.000 (vol/vol) aggiungendo 10 μL di anticorpo a 10 mL di soluzione bloccante del latte scremato al 5% (wt/vol).	Per risultati ottimali, prepara fresco per ogni esperimento. Tuttavia, questa soluzione può essere utilizzata almeno 3 volte senza perdita di efficacia. Conservare a -20 °C in caso di riutilizzo.
	Anticorpo primario β-actina coniugato HRP	Diluire l'anticorpo anti-β-actina 1:5.000 (vol/vol) aggiungendo 2 μL di anticorpo a 10 mL di soluzione bloccante del latte scremato al 5% (wt/vol).	Questo anticorpo deve essere preparato fresco per ogni esperimento.
Anticorpi secondari	Anticorpo anti-coniglio	Diluire l'anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano (HRP) 1:5.000 (vol:vol) aggiungendo 2 μL di anticorpo a 10 mL di soluzione bloccante del latte scremato al 5% (wt/vol).	La diluizione degli anticorpi deve essere preparata fresca ogni volta.
	Anticorpo anti-topo	Diluire l'anticorpo secondario coniugato HRP 1:5.000 (vol:vol) aggiungendo 2 μL di anticorpo a 10 mL di soluzione bloccante del latte scremato al 5% (wt/vol).	La diluizione degli anticorpi deve essere preparata fresca ogni volta.
	Anticorpo anti-ratto	Diluire l'anticorpo secondario coniugato HRP 1:5.000 (vol:vol) aggiungendo 2 μL di anticorpo a 10 mL di soluzione bloccante del latte scremato al 5% (wt/vol).	La diluizione degli anticorpi deve essere preparata fresca ogni volta.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Filtro da 0,45 μm	Millipore	SCHVU05RE
Siringa da 10 ml	BD Bioscienze	309604
piastra a 12 pozzetti	Corning	07-200-82
Ferri da 18 g	BD Bioscienze	305195
Ago da 25 g	BD Bioscienze	305122
Provetta da 50 mL	Fisher Scientifico	50-809-218
Filtro cellulare da 70 μm	Corning	431751
piastre per coltura tissutale da 150 mm	Corning	430597
Pallone per coltura tissutale da 182 cm2	Genesee Scientifico	25-211
ATP	InvivoGen	TLRL-ATPL
BBL Tripticasi Brodo di Soia	BD Bioscienze	211768
Bagno di perline	Chemglass Scienze della Vita	CLS-4598-009
Biofotometro D30	Eppendorf	6133000010
Raschiatori per celle	Prodotti scientifici CellTreat	229315
Camera di CO2	VetEquip	901703
Cuvette	Fisher Scientifico	14-955-129
Forbici da dissezione	Thermo Fisher Scientifico	221S
DMEM	Thermo Fisher Scientifico	Codice 11995-073
etanolo	Pharmco	111000200
Siero fetale bovino	Bioovest	S1620
Carta da filtro	Bio-Rad	1703965
forcipe	Fisher Scientifico	Codice 22-327379
Francisella novicida (ceppo U112)	Risorse BEI	NR-13
Gentamicina	Gibco	15750060
Blocco termico	Fisher Scientifico	Codice 23-043-160
Virus dell'herpes simplex 1 (ceppo HF)	ATCC	VR-260
DMEM ad alto contenuto di glucosio	sigma	D6171
Incubatrice umidificata	Thermo Fisher Scientifico	51026282
IMDM	Thermo Fisher Scientifico	Codice 12440-053
Virus dell'influenza A (A/Porto Rico/8/34, H1N1 [PR8])	costruito secondo Hoffmann et al.
Celle L929	ATCC	CCL-1	Linea cellulare per la creazione di terreni condizionati con L929
L-cisteina	Thermo Fisher Scientifico	BP376-100
Celle MDCK	ATCC	CCL-34	Linea cellulare per la determinazione del titolo virale IAV
Microcentrifuga	Thermo Fisher Scientifico	75002401
Aminoacidi non essenziali	Gibco	11140050
Soluzione NP-40	sigma	492016
Pbs	Thermo Fisher Scientifico	10010023
Penicillina e streptomicina	sigma	P4333
Petri	Fisher Scientifico	07-202-011
PhosSTOP	Roche	PHOSS-RO
Fonte di alimentazione	Bio-Rad	Codice 164-5052
Compressa di inibitore della proteasi	sigma	S8820
idrossido di sodio	sigma	Codice: 72068
Piruvato di sodio	Gibco	Codice 11360-070
Piastra di Petri quadrata	Fisher Scientifico	FB0875711A
Centrifuga da tavolo	Thermo Fisher Scientifico	75004524
Lipopolisaccaride ultrapuro (LPS) da E. coli 0111:B4	InvivoGen	TLRL-3PELP
Celle Vero	ATCC	CCL-81	Linea cellulare per la determinazione del titolo virale HSV1