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Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Analisi delle citochine lacrimali
- Raccolta di lacrime:
- Chiedere al soggetto di sedersi comodamente su una sedia da visita e di appoggiare la testa contro il poggiatesta.
- Chiedi al soggetto di alzare lo sguardo, apri con cautela le strisce di Schirmer (fatte di carta da filtro Whatman n. 41), posiziona l'estremità arrotondata della striscia sul fornice inferiore dell'occhio e chiedi al soggetto di chiudere gli occhi per 5 minuti. Durante la raccolta delle lacrime, prestare molta attenzione a ridurre al minimo il contatto con la superficie oculare.
- Chiedere al soggetto di aprire gli occhi per rimuovere la striscia e metterla in una provetta sterile da microcentrifuga da 1,5 ml. Trasferire immediatamente la provetta in laboratorio o conservarla a -80 oC fino al test per il profilo delle citochine.
- Eluizione del campione lacrimale dalla striscia di flusso lacrimale:
- Tagliare la striscia di flusso lacrimale a una lunghezza di 0,5 cm (per standardizzare la quantità di lacrime da testare) e metterla in una provetta da microcentrifuga sterile da 1,5 mL.
- Aggiungere 30 μl di tampone per il saggio e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti, quindi centrifugare la provetta a 14.000 x g per 1 minuto.
- Trasferire il surnatante in un'altra provetta da microcentrifuga da 1,5 ml ed eliminare la striscia. Posizionare il campione contenente la provetta sul ghiaccio e utilizzare immediatamente il campione lacrimale eluito per la profilazione delle citochine.
- Preparazione dei reagenti:
NOTA: I quarantuno analiti da testare in ciascun campione mediante test multiplex basato su perline sono l'interleuchina (IL)-1α, IL-1β, IL-Rα, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-13, IL-15, IL-17A, interferone-alfa (IFN-α) 2, IFN-γ, proteina 10 inducibile da IFN-gamma (IP-10, CXCL10), chemochina derivata dai macrofagi (MDC), proteina infiammatoria dei macrofagi (MIP)-1α e MIP-1β, proteina chemiotattica dei monociti (MCP)-1, MCP-3, fattore di necrosi tumorale-alfa (TNF-α), TNF-β, oncogene regolato dalla crescita (GRO), fattore di crescita tumorale alfa (TGF-α), fattore di crescita dell'endotelio vascolare (VEGF), fattore di crescita epidermico (EGF), fattore di crescita dei fibroblasti (FGF)-2, fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF)-AA, PDGF-AB/BB, fattore stimolante le colonie di granulociti (G-CSF), fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF), eotaxina, fractalkina, ligando solubile CD40 (sCD40L), ligando Fms-like tirosin-chinasi 3 (Flt-3L) e regolato all'attivazione, proteina normale espressa e secreta dalle cellule T (RANTES).
- Portare i flaconcini della soluzione di perline di anticorpi (50X) a temperatura ambiente (20 – 25 oC) e agitare i flaconcini per 1 minuto.
- Contare il numero di pozzetti necessari per il test e calcolare la quantità di soluzione totale di cocktail di perle di anticorpi (25 μl per pozzetto) e ciascuna soluzione di microsfere di anticorpi (50X) necessaria per il saggio.
- Preparare la soluzione cocktail aggiungendo la quantità calcolata di ciascuna soluzione di perle di anticorpi e riempire fino al volume finale desiderato aggiungendo la quantità rimanente di diluente per microsfere. Assicurarsi che la concentrazione finale di ciascun anticorpo nel cocktail sia 1X. Preparare sempre almeno il 20% in più di volume di soluzione per cocktail in caso di errori di pipettaggio.
nota: Ad esempio, per un saggio a 96 pozzetti, preparare 3000 μL di soluzione cocktail di perline di anticorpi. La quantità richiesta di ciascuna soluzione di perle di anticorpi = 3000/concentrazione stock di ciascuna soluzione di microsfere di anticorpi; 3000/50 = 60 μl di ciascuna soluzione di microsfere di anticorpi
- Aggiungere 60 μl di ciascuna delle 41 soluzioni di microsfere di anticorpi (60 X 41 = 2460 μl) in un flacone da cocktail e aggiungere 540 μl di soluzione diluente per microsfere alla miscela di microsfere di anticorpi per ottenere 3000 μl di soluzione di lavoro finale (1X).
- Prima dell'uso, mescolare correttamente la soluzione di cocktail di perline. Dopo il test, conservare il volume rimanente a 2-8 oC per un massimo di 30 giorni.
- Preparare i controlli di qualità (QC) aggiungendo 250 μL di acqua deionizzata alle scorte QC 1 e QC 2.
- Mescolare bene capovolgendo più volte le bottiglie e agitando per 10 secondi. Trasferire la soluzione in provette per microcentrifuga in polipropilene adeguatamente etichettate e conservare la soluzione rimanente a -20 oC che può essere utilizzata per un massimo di 30 giorni.
- Preparare il tampone di lavaggio aggiungendo 270 ml di acqua deionizzata a 30 ml di soluzione tampone di lavaggio 10X e mescolare bene (prima della diluizione, portare il tampone 10X a temperatura ambiente e sciogliere tutti i precipitati di sale mescolando). Conservare il tampone di lavaggio (1X) non utilizzato a 2-8 °C, che può essere utilizzato per un massimo di 30 giorni.
- Preparare lo stock standard di citochine umane (10.000 pg/mL di tutti gli analiti) aggiungendo 250 μL di acqua deionizzata al flaconcino di riserva. Mescolare bene capovolgendo più volte e facendo girare la fiala per 10 secondi. Lasciar riposare per 10 minuti e trasferire la soluzione madre in provette per microcentrifuga in polipropilene adeguatamente etichettate. Dopo il test, conservare la soluzione rimanente a -20 oC, che può essere utilizzata per un massimo di 30 giorni.
- Preparare gli standard di lavoro delle citochine umane mediante diluizioni seriali di 5 volte (50 μL -> 200 μL) con tampone di saggio per ottenere 2000, 400, 80, 16 e 3,2 pg/mL.
- Dopo la preparazione standard, utilizzare gli standard di lavoro entro 60 minuti e utilizzare il tampone di analisi come bianco/sfondo (-pg/mL).
- Profilazione delle citochine mediante saggio multiplex basato su bigere:
- Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente e agitare per 5-10 secondi prima di aggiungerli alla piastra per microtitolazione a 96 pozzetti. Se i campioni di lacrima eluiti vengono conservati a -80 oC prima del saggio, scongelare gli estratti di lacrime congelati su ghiaccio e centrifugare a 1000 X g per 5 minuti.
- Preparare un foglio di lavoro del saggio in una configurazione verticale per gli standard di citochine umane funzionanti [0 (vuoto), 3,2, 16, 80, 400, 2.000 e 10.000 pg/mL], QC1, QC2 e campioni.
- Aggiungere 200 μl di tampone di lavaggio 1X a ciascun pozzetto della piastra, sigillarlo con un sigillante per piastre e tenerlo su uno shaker per piastre a temperatura ambiente (20-25 oC) per 10 minuti.
- Decantare il tampone di lavaggio 1X capovolgendo la piastra e fissandola più volte su asciugamani assorbenti per rimuovere la quantità residua di tampone di lavaggio nei pozzetti.
- Aggiungere 25 μl di ogni standard di citochine umane funzionante, QC1, QC2, bianco (tampone di saggio) e campioni nei pozzetti appropriati.
- Aggiungere 25 μl di tampone per il saggio in ciascun pozzetto.
- Aggiungere 25 μL di soluzione cocktail di perline di anticorpi 1X in ciascun pozzetto. Poiché la soluzione di perline di anticorpi è sensibile alla luce, sigillare la piastra con un sigillante per piastre e coprirla con un foglio di alluminio per proteggerla dalla luce durante il saggio.
- Incubare la piastra a 4 oC per una notte su un agitatore.
- Posizionare la piastra sulla griglia per lastre di una lavapiatti magnetica automatica. Lasciare riposare per 1 minuto per depositare le perle magnetiche sul fondo del pozzetto e aspirare il contenuto del pozzetto. Aggiungere 200 μl di tampone di lavaggio per pozzetto, lasciare riposare per 1 minuto e poi aspirare il contenuto del pozzetto. Ripetere nuovamente il lavaggio (per il lavaggio delle lastre, seguire le istruzioni del produttore del kit).
- Aggiungere 25 μl di soluzione di anticorpi di rilevazione in ciascun pozzetto, sigillare la piastra, coprirla con un foglio di alluminio e incubare a temperatura ambiente per 60 minuti su un agitatore.
- Aggiungere 25 μl di soluzione di streptavidina-ficoeritrina in ogni pozzetto, sigillare la piastra, coprirla con un foglio di alluminio e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti su uno shaker.
- Posizionare la piastra su una rondella magnetica. Lasciate riposare per 1 minuto e poi aspirate il contenuto del pozzo. Aggiungere 200 μl di tampone di lavaggio per pozzetto. Lasciate riposare per 1 minuto e poi aspirate il contenuto del pozzo. Ripetere nuovamente il lavaggio.
- Aggiungere 150 μL di liquido di guaina in ciascun pozzetto e posizionare la piastra su uno shaker per 5 minuti a temperatura ambiente per risospendere le perle di anticorpi.
- Leggere immediatamente la piastra utilizzando il lettore di piastre per saggi multiplex basato su microsfere e analizzare le concentrazioni di citochine utilizzando un algoritmo di adattamento della curva a 5 parametri. Un diagramma di flusso schematico del profilo delle citochine lacrimali è mostrato nella Figura 1.
- Lettura della piastra di analisi (configurazione dello strumento) e analisi dei dati:
- Accendere il lettore di saggi multiplex basato su microsfere e preriscaldare il laser per 30 minuti.
- Avviare il software di analisi multiplex basato su microsfere. Nella scheda "Manutenzione automatizzata", seleziona l'opzione "Verifica calibrazione". Agitare ogni fiala di reagente delle microsfere di calibrazione e verifica per 30 secondi. Mettere 5 gocce di ciascun reagente nei pozzetti designati. Riempire i serbatoi designati con acqua deionizzata ed etanolo al 70%.
