Utilizzo dell'ibridazione in situ a fluorescenza immuno-RNA per visualizzare SARS-CoV-2

1. SARS-CoV-2 RNA-FISH in cellule Vero coltivate su vetrini coprioggetti

GIORNO 1

1. Celle fissanti e permeabilizzanti
   1. Fissare le cellule infette con una soluzione di PFA al 3,7% p/v per 1 ora a RT.
   2. Aspirare la soluzione di PFA al 3,7% e lavare le cellule due volte utilizzando 1x PBS.
   3. Permeabilizzare le cellule con la soluzione di PBST per 10 minuti a RT con agitazione.
   4. Aspirare il PBST e lavare le cellule due volte con 1x PBS.
2. scoperta
   1. Aspirare la soluzione 1x PBS e lavare le cellule due volte con 2x SSC a RT.
   2. Aspirare la soluzione 2x SSC e preibridare i campioni aggiungendo almeno 300 μL di tampone di ibridazione della sonda. Coprire i pozzetti contenenti le cellule e incubare a 37 °C per 30 minuti.
   3. Preparare la soluzione della sonda aggiungendo 1,2 pmol di miscela di sonde al tampone di ibridazione della sonda.
      1. Utilizzare 1,2 μl della sonda da 1 μM per preparare 300 μl di materiale di lavoro.
   4. Rimuovere la soluzione di preibridazione e trasferire i vetrini coprioggetti in una camera umidificata.
      1. Pipettare 30-50 μl di soluzione della sonda sul parafilm per formare singole goccioline.
   5. Incubare i campioni per una notte (12-18 h) a 37 °C.

GIORNO 2

1. Trasferire nuovamente i vetrini coprioggetti in una piastra a 12 pozzetti e rimuovere la soluzione della sonda in eccesso lavando per 4 x 5 minuti con 400 μL di tampone di lavaggio della sonda a 37 °C.
   nota: In alternativa all'inserimento di aliquote da 30-50 μl su parafilm e sotto i vetrini coprioggetti per l'incubazione, aggiungere 300 μl di soluzione della sonda direttamente ai vetrini coprioggetti in una piastra a 12 pozzetti. Questa procedura è più semplice ma richiede notevoli quantità di reagenti. Riscaldare il tampone di lavaggio della sonda a 37 °C prima dell'uso. Calcolare la quantità di tampone necessaria e trasferirla in una provetta da centrifuga conica da 15 mL.
2. Lavare i campioni per 2 x 5 minuti con 5x SSCT a RT.
3. Sostituire la soluzione 5x SSCT con 1x PBS e conservare i campioni a 4 °C fino all'amplificazione.

3. Amplificazione

1. Rimuovere la soluzione 1x PBS dai pozzetti e aggiungere almeno 300 μl di tampone di amplificazione a ciascun pozzetto. Incubare i campioni per 30 minuti a RT.
2. Preparare ogni forcina HCR (h1 e h2) raffreddando a scatto il volume desiderato in provette separate.
   1. Per preparare 300 μl di soluzione di amplificazione, utilizzare 18 pmol di ciascuna forcina (ad esempio, per 300 μl, utilizzare 6 μl di una soluzione stock di forcina da 3 μM).
   2. Trasferire la soluzione di forcina in tubi.
   3. Incubare a 95 °C per 90 s.
   4. Raffreddare a RT per 30 minuti al buio.
3. Preparare una miscela di forcine aggiungendo le forcine "h1" e "h2" raffreddate a scatto al buffer di amplificazione.
4. Applicare gocce di 30-50 μl di miscela per forcine sul parafilm.
5. Incubare i campioni per una notte (12-18 ore) al buio a RT.

GIORNO 3

6. Trasferire nuovamente i vetrini coprioggetti nella piastra a 12 pozzetti e rimuovere le forcine in eccesso lavando per 5 x 5 minuti con 5x SSCT a RT con agitazione.
7. Aspirare il tampone SSCT 5x e sostituirlo con 1x PBS.
   nota: Se necessario, utilizzare i campioni di RNA-FISH in un test standard di immunofluorescenza, seguito dalla colorazione dei nuclei (vedere paragrafo 1.4).

4. Colorazione nucleare e montaggio su vetrino

1. Aspirare la soluzione 1x PBS e sostituirla con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, 0,2 μg/mL) in 1x soluzione PBS.
2. Incubare i campioni per 10 minuti a RT al buio.
3. Aspirare la soluzione DAPI e lavare le cellule due volte con 1x PBS.
4. Collocare due gocce da 10 μl ciascuna di mezzo di montaggio; assicurarsi che le gocce siano sufficientemente separate da consentire il posizionamento di due vetrini coprioggetti su un singolo vetrino.
5. Rimuovere il liquido in eccesso picchiettando i vetrini coprioggetti su un asciugamano pulito, quindi posizionarli in un mezzo di montaggio antisbiadimento con le celle rivolte verso il basso.
6. Posizionare i campioni montati su una superficie asciutta e piana al buio e lasciarli indurire.
7. Dopo l'indurimento, sigillare i bordi dei vetrini coprioggetti con sigillante VALAP o smalto per unghie per evitare che i campioni si secchino.

2. SARS-CoV-2 RNA-FISH nelle colture di HAE

GIORNO 1

1. Fissazione e permeabilizzazione della coltura di HAE
   1. Aspirare il terreno e fissare le cellule infette utilizzando una soluzione di PFA al 3,7% per 1 ora a RT.
   2. Aspirare la soluzione di PFA al 3,7% e lavare le cellule due volte con 1x PBS.
      1. Sostituire la soluzione di PFA al 3,7% con 1x PBS sotto un inserto Transwell.
   3. Scartare il PBS e disidratare i campioni utilizzando 2 lavaggi da 5 minuti con 100% MeOH preraffreddato a -20 °C.
   4. Dopo il secondo lavaggio, sostituire il tampone con MeOH fresco e refrigerato per la permeabilizzazione sotto l'inserto Transwell. Conservare per una notte a -20 °C.

GIORNO 2

2. Reidratazione
   Reidratare i campioni attraverso una serie graduata di soluzioni di MeOH/PBST (ciascuna per 5 minuti) su ghiaccio: 75% MeOH/25% PBST, 50% MeOH/50% PBST, 25% MeOH/75% PBTS e 100% PBST (due volte).
   1. Lavare le celle per 5 minuti con ghiaccio al 50% 5x SSCT/50% PBST.
   2. Lavare le celle per 5 minuti su ghiaccio con 5x SSCT.
   3. Sostituire il buffer SSCT 5x con 1x PBS.
3. scoperta
   1. Incubare le cellule (all'interno dell'inserto Transwell) per 5 minuti su ghiaccio con 100 μL di tampone di ibridazione della sonda. Quindi, trasferire la piastra in un'incubatrice per 30 minuti a 37 °C (preibridazione).
      nota: Il tampone di ibridazione della sonda deve essere preriscaldato a 37 °C prima dell'uso. Calcola il volume richiesto: 100 μL sono necessari per un singolo inserto Transwell.
   2. Preparare la soluzione della sonda. Poiché 1 mL di soluzione della sonda richiede 4 pmol di sonda, aggiungere 4 μL di soluzione madre della sonda da 1 μM a 1 mL di tampone di ibridazione della sonda e mescolare bene.
      nota: Per la rilevazione dell'RNA, utilizzare 100 μL di soluzione della sonda per inserto Transwell. Lasciare la soluzione della sonda sul ghiaccio fino alla fine della fase di preibridazione.
   3. Rimuovere la soluzione di preibridazione e aggiungere la soluzione sonda.
   4. Incubare le cellule per una notte (12-18 h) a 37 °C.

GIORNO 3

5. Rimuovere la sonda in eccesso lavando per 4 x 15 minuti con 100 μL di tampone di lavaggio della sonda a 37 °C.
6. Lavare i campioni per 2 x 5 minuti con 5x SSCT a RT.
7. Sostituire il 5x SSCT con 1x PBS e conservare i campioni a 4 °C fino all'amplificazione.

4. amplificazione

1. Preamplificare i campioni incubandoli con un tampone di amplificazione per 30 minuti a RT.
2. Preparare ogni forcina raffreddando a scatto i volumi desiderati in tubi separati.
   1. Per preparare 500 μL di soluzione di amplificazione, utilizzare 30 pmol di ciascuna forcina (ad esempio, per 500 μL, utilizzare 10 μL di soluzione stock a forcina da 3 μM).
   2. Trasferire la soluzione di forcina nei tubi.
   3. Incubare a 95 °C per 90 s.
   4. Raffreddare a RT per 30 minuti al buio.
3. Preparare la soluzione di forcina aggiungendo tutte le forcine raffreddate a scatto a 500 μL di tampone di amplificazione a RT.
4. Rimuovere la soluzione di preamplificazione e aggiungere la soluzione completa di forcina.
5. Incubare i campioni durante la notte (12-18 ore) a RT al buio.
6. Rimuovere le forcine in eccesso lavando con 5 SSCT a RT come segue: 2 x 5 min, 2 x 15 min e 1 x 5 min.
7. Sostituire la soluzione 5x SSCT con 1x PBS e conservare a 4 °C per non più di 2-3 giorni, oppure procedere direttamente alla colorazione nucleare.
   nota: Se necessario, utilizzare i campioni di RNA-FISH in un test standard di immunofluorescenza, seguito da colorazione nucleare (vedere paragrafo 3).

5. Colorazione nucleare e montaggio su vetrino

1. Aspirare la soluzione 1x PBS e sostituirla con la soluzione DAPI (0,2 μg/mL) in 1x PBS.
2. Incubare i campioni per 10 minuti a RT al buio.
3. Aspirare la soluzione DAPI e lavare le cellule due volte con 1x PBS.
4. Posizionare la membrana ritagliata dagli inserti Transwell su 10 μL di terreno di montaggio antisbiadimento con le celle rivolte verso l'alto e aggiungere ulteriore mezzo di montaggio (5 μL) alla membrana.
5. Coprire le membrane con vetrini.
6. Polimerizzare i campioni montati su una superficie asciutta e piana al buio.
7. Dopo l'indurimento, sigillare i bordi dei vetrini coprioggetti con sigillante VALAP o smalto per unghie per evitare che i campioni si secchino.

3. Analisi in immunofluorescenza di cellule Vero e colture di HAE

NOTA: Eseguire il test di immunofluorescenza il giorno 3 per le linee cellulari o il giorno 4 per le colture di AEE. Utilizzare un approccio diverso per ogni modello. Tutte le differenze sono indicate chiaramente.

1. Aspirare la soluzione 1x PBS dai pozzetti.
2. Bloccare i campioni mediante incubazione con albumina sierica bovina all'1% p/v in soluzione PBST per 30 minuti a 37 °C.
3. Preparare gli anticorpi primari preparando le diluizioni appropriate in soluzione bloccante e incubare.
   1. Per le celle Vero sui vetrini:
      1. Posizionare gocce (30-50 μL) di soluzione anticorpale sul parafilm in una camera di umidità.
      2. Posizionare i vetrini coprioggetti sulle gocce di anticorpi con le cellule rivolte verso il basso.
   2. Per l'HAE, sostituire l'agente bloccante negli inserti con una soluzione di anticorpi (100 μL) e incubare i campioni in una camera umidificata.
      NOTA: Regolare il tempo e la temperatura per ogni incubazione con l'anticorpo primario. I parametri tipici sono 2 h a RT o overnight a 4 °C.
4. Lavare i campioni per 3 x 5 minuti con PBST.
   1. Per le cellule sui vetrini coprioggetti, trasferire in una piastra a 12 pozzetti e aggiungere la soluzione PBST.
   2. Per le colture di AEE, sostituire la soluzione anticorpale con la soluzione PBST.
5. Controllare le sorgenti luminose e i filtri disponibili per il microscopio confocale.
6. Scegliere gli anticorpi secondari in base alla specie ospite. Scegliere i parametri del fluoroforo (lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione, ampiezza dello spettro ed efficienza di eccitazione in base alla sorgente luminosa disponibile).
   nota: I parametri spettrali possono essere modellati utilizzando strumenti online (vedi Tabella dei materiali).
7. Preparare le soluzioni di anticorpi secondari appropriate diluendole con una soluzione bloccante.
8. Incubare con anticorpi secondari (come in 6.3), ma incubare per 1 ora a 37 °C.
9. Lavare i campioni come al punto 3.4.
10. Colorazione nucleare e montaggio di vetrini
    1. Per celle su vetrini coprioggetti
       1. Aspirare il PBST e sostituirlo con DAPI (0,2 μg/mL) in 1 soluzione PBS.
       2. Incubare i campioni per 10 minuti a RT al buio.
       3. Aspirare la soluzione DAPI e lavare le cellule due volte con 1x PBS.
       4. Posizionare i vetrini coprioggetti su gocce da 10 μl di terreno di montaggio con le celle rivolte verso il basso.
       5. Sigillare i vetrini coprioggetti con lo smalto per unghie.
    2. Per colture di HAE
       1. Aspirare 1x PBST e sostituirlo con DAPI (0,2 μg/mL) in 1x soluzione PBS.
       2. Incubare i campioni per 10 minuti a RT al buio.
       3. Aspirare la soluzione DAPI e lavare le cellule due volte con 1x PBS.
       4. Posizionare le membrane ritagliate su gocce da 10 μl di terreno di montaggio con le celle rivolte verso l'alto e aggiungere un ulteriore mezzo di montaggio (5 μl) alla membrana.
       5. Coprire le membrane con vetrini.
       6. Sigillare i vetrini coprioggetti con lo smalto per unghie.

4. Microscopia confocale

1. Definire le tracce specificando i fluorofori utilizzati.
2. Scegli la modalità di scansione e la velocità.
3. Regolare i valori di potenza, guadagno e offset del laser per ciascun fluoroforo confrontandoli con i rispettivi controlli negativi: per virus, cellule finte infette; per proteine cellulari, campioni colorati con anticorpi di controllo isotipo da un ospite appropriato.
4. Per acquisire un'immagine 3D, attivare la modalità z-stack e impostare i limiti superiore e inferiore. Imposta la dimensione/numero del passo.
   nota: Per maggiori dettagli sull'imaging del coronavirus.