1. SARS-CoV-2 RNA-FISH in cellule Vero coltivate su vetrini coprioggetti
GIORNO 1
- Celle fissanti e permeabilizzanti
- Fissare le cellule infette con una soluzione di PFA al 3,7% p/v per 1 ora a RT.
- Aspirare la soluzione di PFA al 3,7% e lavare le cellule due volte utilizzando 1x PBS.
- Permeabilizzare le cellule con la soluzione di PBST per 10 minuti a RT con agitazione.
- Aspirare il PBST e lavare le cellule due volte con 1x PBS.
- scoperta
- Aspirare la soluzione 1x PBS e lavare le cellule due volte con 2x SSC a RT.
- Aspirare la soluzione 2x SSC e preibridare i campioni aggiungendo almeno 300 μL di tampone di ibridazione della sonda. Coprire i pozzetti contenenti le cellule e incubare a 37 °C per 30 minuti.
- Preparare la soluzione della sonda aggiungendo 1,2 pmol di miscela di sonde al tampone di ibridazione della sonda.
- Utilizzare 1,2 μl della sonda da 1 μM per preparare 300 μl di materiale di lavoro.
- Rimuovere la soluzione di preibridazione e trasferire i vetrini coprioggetti in una camera umidificata.
- Pipettare 30-50 μl di soluzione della sonda sul parafilm per formare singole goccioline.
- Incubare i campioni per una notte (12-18 h) a 37 °C.
GIORNO 2
- Trasferire nuovamente i vetrini coprioggetti in una piastra a 12 pozzetti e rimuovere la soluzione della sonda in eccesso lavando per 4 x 5 minuti con 400 μL di tampone di lavaggio della sonda a 37 °C.
nota: In alternativa all'inserimento di aliquote da 30-50 μl su parafilm e sotto i vetrini coprioggetti per l'incubazione, aggiungere 300 μl di soluzione della sonda direttamente ai vetrini coprioggetti in una piastra a 12 pozzetti. Questa procedura è più semplice ma richiede notevoli quantità di reagenti. Riscaldare il tampone di lavaggio della sonda a 37 °C prima dell'uso. Calcolare la quantità di tampone necessaria e trasferirla in una provetta da centrifuga conica da 15 mL.
- Lavare i campioni per 2 x 5 minuti con 5x SSCT a RT.
- Sostituire la soluzione 5x SSCT con 1x PBS e conservare i campioni a 4 °C fino all'amplificazione.
3. Amplificazione
- Rimuovere la soluzione 1x PBS dai pozzetti e aggiungere almeno 300 μl di tampone di amplificazione a ciascun pozzetto. Incubare i campioni per 30 minuti a RT.
- Preparare ogni forcina HCR (h1 e h2) raffreddando a scatto il volume desiderato in provette separate.
- Per preparare 300 μl di soluzione di amplificazione, utilizzare 18 pmol di ciascuna forcina (ad esempio, per 300 μl, utilizzare 6 μl di una soluzione stock di forcina da 3 μM).
- Trasferire la soluzione di forcina in tubi.
- Incubare a 95 °C per 90 s.
- Raffreddare a RT per 30 minuti al buio.
- Preparare una miscela di forcine aggiungendo le forcine "h1" e "h2" raffreddate a scatto al buffer di amplificazione.
- Applicare gocce di 30-50 μl di miscela per forcine sul parafilm.
- Incubare i campioni per una notte (12-18 ore) al buio a RT.
GIORNO 3
- Trasferire nuovamente i vetrini coprioggetti nella piastra a 12 pozzetti e rimuovere le forcine in eccesso lavando per 5 x 5 minuti con 5x SSCT a RT con agitazione.
- Aspirare il tampone SSCT 5x e sostituirlo con 1x PBS.
nota: Se necessario, utilizzare i campioni di RNA-FISH in un test standard di immunofluorescenza, seguito dalla colorazione dei nuclei (vedere paragrafo 1.4).
4. Colorazione nucleare e montaggio su vetrino
- Aspirare la soluzione 1x PBS e sostituirla con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, 0,2 μg/mL) in 1x soluzione PBS.
- Incubare i campioni per 10 minuti a RT al buio.
- Aspirare la soluzione DAPI e lavare le cellule due volte con 1x PBS.
- Collocare due gocce da 10 μl ciascuna di mezzo di montaggio; assicurarsi che le gocce siano sufficientemente separate da consentire il posizionamento di due vetrini coprioggetti su un singolo vetrino.
- Rimuovere il liquido in eccesso picchiettando i vetrini coprioggetti su un asciugamano pulito, quindi posizionarli in un mezzo di montaggio antisbiadimento con le celle rivolte verso il basso.
- Posizionare i campioni montati su una superficie asciutta e piana al buio e lasciarli indurire.
- Dopo l'indurimento, sigillare i bordi dei vetrini coprioggetti con sigillante VALAP o smalto per unghie per evitare che i campioni si secchino.
2. SARS-CoV-2 RNA-FISH nelle colture di HAE
GIORNO 1
- Fissazione e permeabilizzazione della coltura di HAE
- Aspirare il terreno e fissare le cellule infette utilizzando una soluzione di PFA al 3,7% per 1 ora a RT.
- Aspirare la soluzione di PFA al 3,7% e lavare le cellule due volte con 1x PBS.
- Sostituire la soluzione di PFA al 3,7% con 1x PBS sotto un inserto Transwell.
- Scartare il PBS e disidratare i campioni utilizzando 2 lavaggi da 5 minuti con 100% MeOH preraffreddato a -20 °C.
- Dopo il secondo lavaggio, sostituire il tampone con MeOH fresco e refrigerato per la permeabilizzazione sotto l'inserto Transwell. Conservare per una notte a -20 °C.
GIORNO 2
- Reidratazione
Reidratare i campioni attraverso una serie graduata di soluzioni di MeOH/PBST (ciascuna per 5 minuti) su ghiaccio: 75% MeOH/25% PBST, 50% MeOH/50% PBST, 25% MeOH/75% PBTS e 100% PBST (due volte).
- Lavare le celle per 5 minuti con ghiaccio al 50% 5x SSCT/50% PBST.
- Lavare le celle per 5 minuti su ghiaccio con 5x SSCT.
- Sostituire il buffer SSCT 5x con 1x PBS.
- scoperta
- Incubare le cellule (all'interno dell'inserto Transwell) per 5 minuti su ghiaccio con 100 μL di tampone di ibridazione della sonda. Quindi, trasferire la piastra in un'incubatrice per 30 minuti a 37 °C (preibridazione).
nota: Il tampone di ibridazione della sonda deve essere preriscaldato a 37 °C prima dell'uso. Calcola il volume richiesto: 100 μL sono necessari per un singolo inserto Transwell.
- Preparare la soluzione della sonda. Poiché 1 mL di soluzione della sonda richiede 4 pmol di sonda, aggiungere 4 μL di soluzione madre della sonda da 1 μM a 1 mL di tampone di ibridazione della sonda e mescolare bene.
nota: Per la rilevazione dell'RNA, utilizzare 100 μL di soluzione della sonda per inserto Transwell. Lasciare la soluzione della sonda sul ghiaccio fino alla fine della fase di preibridazione.
- Rimuovere la soluzione di preibridazione e aggiungere la soluzione sonda.
- Incubare le cellule per una notte (12-18 h) a 37 °C.
GIORNO 3
- Rimuovere la sonda in eccesso lavando per 4 x 15 minuti con 100 μL di tampone di lavaggio della sonda a 37 °C.
- Lavare i campioni per 2 x 5 minuti con 5x SSCT a RT.
- Sostituire il 5x SSCT con 1x PBS e conservare i campioni a 4 °C fino all'amplificazione.
- amplificazione
- Preamplificare i campioni incubandoli con un tampone di amplificazione per 30 minuti a RT.
- Preparare ogni forcina raffreddando a scatto i volumi desiderati in tubi separati.
- Per preparare 500 μL di soluzione di amplificazione, utilizzare 30 pmol di ciascuna forcina (ad esempio, per 500 μL, utilizzare 10 μL di soluzione stock a forcina da 3 μM).
- Trasferire la soluzione di forcina nei tubi.
- Incubare a 95 °C per 90 s.
- Raffreddare a RT per 30 minuti al buio.
- Preparare la soluzione di forcina aggiungendo tutte le forcine raffreddate a scatto a 500 μL di tampone di amplificazione a RT.
- Rimuovere la soluzione di preamplificazione e aggiungere la soluzione completa di forcina.
- Incubare i campioni durante la notte (12-18 ore) a RT al buio.
- Rimuovere le forcine in eccesso lavando con 5 SSCT a RT come segue: 2 x 5 min, 2 x 15 min e 1 x 5 min.
- Sostituire la soluzione 5x SSCT con 1x PBS e conservare a 4 °C per non più di 2-3 giorni, oppure procedere direttamente alla colorazione nucleare.
nota: Se necessario, utilizzare i campioni di RNA-FISH in un test standard di immunofluorescenza, seguito da colorazione nucleare (vedere paragrafo 3).
5. Colorazione nucleare e montaggio su vetrino
- Aspirare la soluzione 1x PBS e sostituirla con la soluzione DAPI (0,2 μg/mL) in 1x PBS.
- Incubare i campioni per 10 minuti a RT al buio.
- Aspirare la soluzione DAPI e lavare le cellule due volte con 1x PBS.
- Posizionare la membrana ritagliata dagli inserti Transwell su 10 μL di terreno di montaggio antisbiadimento con le celle rivolte verso l'alto e aggiungere ulteriore mezzo di montaggio (5 μL) alla membrana.
- Coprire le membrane con vetrini.
- Polimerizzare i campioni montati su una superficie asciutta e piana al buio.
- Dopo l'indurimento, sigillare i bordi dei vetrini coprioggetti con sigillante VALAP o smalto per unghie per evitare che i campioni si secchino.
3. Analisi in immunofluorescenza di cellule Vero e colture di HAE
NOTA: Eseguire il test di immunofluorescenza il giorno 3 per le linee cellulari o il giorno 4 per le colture di AEE. Utilizzare un approccio diverso per ogni modello. Tutte le differenze sono indicate chiaramente.
- Aspirare la soluzione 1x PBS dai pozzetti.
- Bloccare i campioni mediante incubazione con albumina sierica bovina all'1% p/v in soluzione PBST per 30 minuti a 37 °C.
- Preparare gli anticorpi primari preparando le diluizioni appropriate in soluzione bloccante e incubare.
- Per le celle Vero sui vetrini:
- Posizionare gocce (30-50 μL) di soluzione anticorpale sul parafilm in una camera di umidità.
- Posizionare i vetrini coprioggetti sulle gocce di anticorpi con le cellule rivolte verso il basso.
- Per l'HAE, sostituire l'agente bloccante negli inserti con una soluzione di anticorpi (100 μL) e incubare i campioni in una camera umidificata.
NOTA: Regolare il tempo e la temperatura per ogni incubazione con l'anticorpo primario. I parametri tipici sono 2 h a RT o overnight a 4 °C.
- Lavare i campioni per 3 x 5 minuti con PBST.
- Per le cellule sui vetrini coprioggetti, trasferire in una piastra a 12 pozzetti e aggiungere la soluzione PBST.
- Per le colture di AEE, sostituire la soluzione anticorpale con la soluzione PBST.
- Controllare le sorgenti luminose e i filtri disponibili per il microscopio confocale.
- Scegliere gli anticorpi secondari in base alla specie ospite. Scegliere i parametri del fluoroforo (lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione, ampiezza dello spettro ed efficienza di eccitazione in base alla sorgente luminosa disponibile).
nota: I parametri spettrali possono essere modellati utilizzando strumenti online (vedi Tabella dei materiali).
- Preparare le soluzioni di anticorpi secondari appropriate diluendole con una soluzione bloccante.
- Incubare con anticorpi secondari (come in 6.3), ma incubare per 1 ora a 37 °C.
- Lavare i campioni come al punto 3.4.
- Colorazione nucleare e montaggio di vetrini
- Per celle su vetrini coprioggetti
- Aspirare il PBST e sostituirlo con DAPI (0,2 μg/mL) in 1 soluzione PBS.
- Incubare i campioni per 10 minuti a RT al buio.
- Aspirare la soluzione DAPI e lavare le cellule due volte con 1x PBS.
- Posizionare i vetrini coprioggetti su gocce da 10 μl di terreno di montaggio con le celle rivolte verso il basso.
- Sigillare i vetrini coprioggetti con lo smalto per unghie.
- Per colture di HAE
- Aspirare 1x PBST e sostituirlo con DAPI (0,2 μg/mL) in 1x soluzione PBS.
- Incubare i campioni per 10 minuti a RT al buio.
- Aspirare la soluzione DAPI e lavare le cellule due volte con 1x PBS.
- Posizionare le membrane ritagliate su gocce da 10 μl di terreno di montaggio con le celle rivolte verso l'alto e aggiungere un ulteriore mezzo di montaggio (5 μl) alla membrana.
- Coprire le membrane con vetrini.
- Sigillare i vetrini coprioggetti con lo smalto per unghie.
4. Microscopia confocale
- Definire le tracce specificando i fluorofori utilizzati.
- Scegli la modalità di scansione e la velocità.
- Regolare i valori di potenza, guadagno e offset del laser per ciascun fluoroforo confrontandoli con i rispettivi controlli negativi: per virus, cellule finte infette; per proteine cellulari, campioni colorati con anticorpi di controllo isotipo da un ospite appropriato.
- Per acquisire un'immagine 3D, attivare la modalità z-stack e impostare i limiti superiore e inferiore. Imposta la dimensione/numero del passo.
nota: Per maggiori dettagli sull'imaging del coronavirus.
