Tutti i virus influenzali devono essere maneggiati secondo i requisiti del livello di biosicurezza appropriato (BSL-2 o superiore) come definito nella Biosicurezza nei Laboratori Microbiologici e Biomedici (BMBL).
1. Preparazione dei reagenti e del materiale di partenza
- Preparare le cellule di rene canino Madine Darby-α2,6-sial transferasi (MDCK-SIAT1) e il terreno di coltura cellulare sterile
- Preparare il terreno di coltura cellulare MDCK-SIAT1 utilizzando 500 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ad alto contenuto di glucosio, 10% v/v di siero fetale bovino inattivato termicamente (FBS), 2 mM di L-glutammina, 1 mM di piruvato di sodio, 1 mg/mL di solfato G418 (ad es. geneticina) e 100 U/ml di penicillina con 100 μg/mL di streptomicina (opzionale). Sterilizzare mediante filtrazione attraverso una membrana con pori da 0,2 μM. Il solfato G418 viene aggiunto per garantire la stabilità del plasmide nelle cellule MDCK-SIAT1.
- Preparare la linea cellulare MDCK-SIAT1. In un pallone o in un pallone per colture tissutali da 162cm2 contenenti 30 ml di terreno di coltura cellulare sterile, palloni di semina con 2 - 2,5 x 106 cellule MDCK-SIAT1 e incubare a 37 °C in CO2 al 5% per 2 giorni; questo sarà utilizzato per la determinazione della dose infettiva in coltura tissutale (TCID) e per i saggi MN.
nota: Le cellule MDCK-SIAT1 sono state gentilmente fornite dal Dr. M. Matrosovich, Marburgo, Germania. Questa linea cellulare può essere ottenuta anche commercialmente (vedi la Tabella dei Materiali).
- Preparare il terreno sterile di propagazione del virus utilizzando 500 mL di DMEM ad alto contenuto di glucosio, 0,3% di albumina sierica bovina (BSA) frazione V, 100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina e 20 mM di acido N-2-idrossietilpiperazina-N'-2-etansolfonico (HEPES). Sterilizzare mediante filtrazione attraverso una membrana con pori da 0,2 μM.
- Preparare i globuli rossi (gpRBC) di cavia allo 0,75% (v/v) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente 0,01 M di PBS, a pH 7,2.
- Preparare il diluente virale sterile utilizzando DMEM ad alto contenuto di glucosio, albumina bovina all'1% frazione V (BSA), 100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina e 20 mM di HEPES. Sterilizzare mediante filtrazione con una membrana di dimensioni pari a 0,2 μm e preparare fresco per ogni test.
- Preparare il fissativo a celle fredde come acetone freddo all'80% in PBS (0,01 M PBS, pH 7,2).
- Preparare il tampone di lavaggio utilizzando PBS (0,01 M, PBS, pH 7,2) e 0,3% (v/v) tween-20.
- Preparare il diluente anticorpale utilizzando PBS (0,01 M PBS, pH 7,2), 0,3% (v/v) tween-20 e 5% latte in polvere scremato.
- Utilizzare gli anticorpi monoclonali di topo anti-influenza A NP cloni A1 e A3 del pool come anticorpo primario. Diluire nel diluente anticorpale alla concentrazione ottimale determinata mediante titolazione.
- Utilizzare le IgG anti-topo di capra coniugate alla perossidasi di rafano (HRP) come anticorpo secondario. Diluire nel diluente anticorpale alla concentrazione ottimale determinata mediante titolazione.
- Preparare il substrato della perossidasi utilizzando o-fenilendiammina dicloridrato (OPD) in tampone citrato fosfato 0,05 M a pH 5. Preparare il tampone citrato fosfato 0,05 M sciogliendo 1 capsula/100 ml di H2O deionizzato. Sciogliere 1 compressa OPD (10 mg)/20 ml di tampone citrato fosfato immediatamente prima dell'uso.
- Utilizzare 0,5 M di acido solforico come soluzione di arresto OPD. Aggiungere 28 mL di acido solforico 18 M a 972 mL di H2O deionizzato in una cappa chimica.
- Trattamento di sieri umani e animali
- Inattivare a caldo i sieri umani utilizzati nei saggi MN in un bagno d'acqua a 56 °C per 30 minuti prima del saggio. Utilizzare immediatamente o, se necessario, conservare i sieri scongelati a 4 °C per non più di 24 ore; se è necessario un periodo di conservazione più lungo, conservare sera congelati a -20 °C o più freddi.
- Trattare i sieri animali utilizzati nei test MN con l'enzima che distrugge il recettore (RDE) e inattivare il calore prima del test come segue.
- Scongelare il siero a bagnomaria a 37 °C e metterlo in ghiaccio. Mescolare 1 volume di campione di siero animale con 3 volumi di RDE. Incubare a 37 °C per 18 - 20 h.
- Inattivare termicamente i sieri trattati con RDE a 56 °C per 30 minuti. Aggiungere 6 volumi di PBS, pH 7,2 a ciascun campione per una pre-diluizione finale di 1:10. Se necessario, conservare i sieri scongelati a 4 °C per non più di 24 ore; se è necessario un periodo di conservazione più lungo, conservare sera congelati a -20 °C o meno.
nota: I sieri animali possono contenere vari glicani dell'acido sialico che possono legarsi alle emoagglutinine, o HA, dei virus influenzali e inibire il legame degli anticorpi anti-HA specifici per l'influenza. Pertanto, è necessario trattare con RDE tutti i sieri animali prima dei test MN per rimuovere questi leganti virali HA non specifici nei campioni di siero.
2. Passaggio della coltura cellulare MDCK-SIAT1
NOTA: Tutte le colture cellulari devono essere eseguite in una cabina di sicurezza biologica per prevenire la contaminazione.
- Decantare il terreno di coltura cellulare dal monostrato cellulare in fiasche da 162 cm2. Tripsinizzare le cellule risciacquando il monostrato con acido tripsin-etilendiammina tetraacetico (EDTA). Aggiungere 5 mL di tripsina-EDTA per coprire il monostrato cellulare. Incubare a 37 °C, 5% di anidride carbonica, CO2 fino al distacco del monostrato (5-10 min). Aggiungere 15 mL di terreno di coltura cellulare MDCK-SIAT1 a ciascun pallone contenente cellule tripsinizzate e pipettare su e giù per separare le cellule.
- Utilizzare un emocitometro e il blu di tripano per determinare la conta cellulare e la vitalità. Seminare le cellule in nuovi flaconi di coltura tissutale da 162 cm2 contenenti 30 mL di terreno di coltura cellulare con 2-2,5 x 106 cellule/matraccio e incubare a 37 °C con CO2 al 5% per 2 giorni per l'uso nei saggi TCID e MN. Seminare le cellule a 4 - 5 x 106 cellule/matraccio e incubare a 37°C con il 5% di CO2 per 2 giorni per l'uso nella propagazione del virus.
nota: La densità di semina può essere regolata se si desiderano periodi di coltura più brevi o più lunghi. Per la propagazione del virus, le cellule dovrebbero raggiungere una confluenza superiore al 100%. Per i saggi TCID (Tissue Culture Infection Dose) e MN, le cellule devono essere al 75-95% di confluenza (Figura 1).
3. Propagazione dei virus A(H3N2) nelle cellule MDCK-SIAT1
NOTA: Il virus A(H3N2) può essere propagato sia in uova di gallina embrionata di 10 - 11 giorni secondo il protocollo standard, sia in colture cellulari MDCK-SIAT1. Le cellule MDCK-SIAT1 dovrebbero raggiungere oltre il 100% di confluenza per l'inoculazione del virus. Le scorte di semi virali possono essere inoculate con più diluizioni di inoculo. Le diluizioni dell'inoculo con il miglior HA e infettività del raccolto possono essere utilizzate per ulteriori saggi di MN.
- Rimuovere il terreno di coltura cellulare dal monostrato cellulare (>100% di confluenza) in matracci da 162 cm2. Lavare il monostrato due volte con 15 mL di PBS sterile 0,01 M, pH 7,2 e decantare.
- Etichettare 1 pallone come controllo e aggiungere 20 ml di terreno di propagazione del virus. Incubare il matraccio a 37 °C con CO2 al 5%. Lasciare intatta questa fiaschetta e utilizzarla per il confronto dopo il giorno 1 di propagazione del virus.
- Aggiungere 10 mL di terreno di propagazione virale sterile al pallone o ai matracci e incubare tutti i flaconi a 37 °C, 5% di CO2. Scongelare una fiala di brodo per il virus dell'influenza a temperatura ambiente, quindi metterla sul ghiaccio. Diluire con il terreno di propagazione del virus fino alle diluizioni target.
nota: Le diluizioni target possono essere aggiustate in base ai titoli di HA degli stock virali. Per preparare un inoculo diluito 1:1000, aggiungere 100 μL di virus a 9,9 mL di terreno di propagazione virale sterile. Capovolgere delicatamente, rimuovere 1 mL di diluizione 1:100 a 9 mL di terreno di propagazione virale sterile e capovolgere delicatamente per ottenere un inoculo diluito 1:1000. Mettere sul ghiaccio.
- Estrarre dall'incubatrice tutti i palloni tranne il pallone di controllo. Rimuovere il terreno di propagazione del virus dal pallone o dai flaconi delle cellule MDCK-SIAT1 e inoculare in ciascun pallone 10 mL di virus diluito. Incubare i matracci a 37 °C, 5% CO2 per 1 ora, ruotando il pallone o i matracci ogni 15 minuti.
- Rimuovere 5 mL di inoculo dal pallone o dai matracci e sostituirli con 15 mL di terreno di propagazione virale contenente 1 μg/mL di tripsina trattata con clorometilchetone (TPCK-tripsina). Incubare il pallone o i matracci a 37 °C, 5% di CO2 per 16-18 ore.
- Dopo l'incubazione notturna, osservare la/e fiaschetta/e con un ingrandimento al microscopio 100X e cercare gli effetti citopatici (CPE) sulle cellule. Rimuovere 15-17 mL di surnatante virale dal/i pallone/i e sostituirlo con 15-17 mL di terreno di propagazione virale appena preparato contenente 2 μg/mL di TPCK-tripsina.
- Incubare i matracci a 37 °C, 5% CO2. Monitorare il CPE del monostrato (rispetto al pallone di controllo cellulare) e controllare periodicamente (ogni 4 ore) l'HA con gpRBC allo 0,75% fino al prelievo.
- Impostare una piastra per microtitolazione HA a 96 pozzetti. Aggiungere 50 μl di PBS 0,01 M, pH 7,2 ai pozzetti A2 - A12 e B2 - B12 (duplicati) e ai pozzetti H1 - H12 per il controllo.
- Aggiungere 100 μl di surnatante virale ad A1 e A2 ed eseguire una diluizione seriale di 2 volte da A1 e B1 a A12 e B12. Scartare 50 μl dopo la miscelazione in A12 e B12. Aggiungere 50 μl di gpRBC allo 0,75% alle righe A, B e H.
- Picchiettare la piastra e incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
- Determinare l'HA del surnatante virale inclinando la piastra per microtitolazione a 96 pozzetti con un angolo compreso tra 45° e 60°.
- Leggere le piastre per l'emoagglutinazione; la diluizione più elevata del virus che raggiunge l'emoagglutinazione completa è considerata l'endpoint di titolazione dell'HA per il virus specifico. Registrare il reciproco della massima diluizione del virus con emoagglutinazione completa come titolo HA del virus.
nota: I globuli rossi stabilizzati nella fila H (controlli) dovrebbero iniziare a "correre" e formare una piccola forma a goccia a causa della gravità. Attendere che i globuli rossi nei pozzetti di controllo finiscano di funzionare, quindi leggere i pulsanti dei globuli rossi nei pozzetti di titolazione del virus. Coloro che esibiscono i pulsanti RBC e "corrono", non raggiungono l'emoagglutinazione. Individuare la diluizione più alta del virus che inibisce completamente l'emoagglutinazione come titolo HA finale del virus.
- Raccogliere il virus quando l'HA della coltura virale si stabilizza o la coltura virale raggiunge l'HA target (ad esempio, unità >16 HA), ma prima che il monostrato cellulare inizi a mostrare un CPE significativo.
- Centrifugare il surnatante della coltura virale a 300 x g per 10 minuti a 4 °C per pellettare i detriti cellulari. Trasferire il surnatante chiarificato contenente il virus raccolto in una provetta pulita. Aliquotare il surnatante contenente il virus raccolto in fiale criogeniche sterili monouso e congelare immediatamente a -70 °C o meno.
nota: Le scorte di virus utilizzate per i test MN devono avere un alto titolo infettivo e particelle difettose minime. La diluizione minima delle scorte virali per raggiungere 100 TCID50/50 μL per il test MN è 1:100.
nota: Le scorte di virus utilizzate nei test MN non devono essere scongelate e ricongelate.
4. Determinazione del TCID del virus
- Giorno 1: Titolazione del virus
- Scongelare una fiala del virus a temperatura ambiente e metterla immediatamente sul ghiaccio.
- Testare il virus a due diverse diluizioni iniziali: 10-2 e 10-3. Aggiungere 100 μL di virus a 9,9 mL di diluente virale per una diluizione 10-2. Aggiungere 1 mL di diluizione 10-2 a 9,0 mL di diluente virale per una diluizione 10-3.
- Utilizzando due piastre per microtitolazione (piastra 1 per diluizione 10-2 e piastra 2 per diluizione 10-3), aggiungere 100 μl di diluente virale a tutti i pozzetti tranne la colonna 1 della piastra per microtitolazione a 96 pozzetti.
- Eseguire 1/2log10 diluizioni (10-2, 10-2,5, 10-3, ecc.). Aggiungere 146 μl della diluizione iniziale del virus a tutti i pozzetti della colonna 1 e trasferire 46 μl in serie dalla colonna 1 alla colonna 11 (Figura 2). Sostituire i puntali delle pipette tra i pozzetti. Dopo aver miscelato la colonna 11, scartare i puntali con la diluizione di 46 μl.
- Utilizzare la colonna 12 come Cell Control (CC); contiene solo diluente virale. Incubare per 1 ora a 37 °C, 5% CO2.
- Giorno 1: Preparazione delle cellule MDCK-SIAT1
nota: Il monostrato cellulare MDCK-SIAT1 dovrebbe raggiungere una confluenza del 75-95% per i saggi TCID e MN. Un pallone da 162 cm2 al 95% di confluenza dovrebbe produrre abbastanza cellule per seminare ~ 4 - 5 piastre per microtitolazione.
- Lavare il monostrato confluente al 75-95% con 20 mL di PBS per rimuovere l'FBS nel terreno di coltura. Tripsinizzare le cellule come segue.
- Sciacquare il monostrato con PBS sterile e aggiungere 7 ml di tripsina-EDTA per coprire il monostrato cellulare. Stendere il pallone e incubare a 37 °C, 5% CO2 fino al distacco del monostrato (circa 5 - 10 min). Aggiungere 7 mL di diluente virale a ciascun pallone contenente le cellule tripsinizzate.
- Lavare le cellule con diluente virale per rimuovere l'FBS.
- Pipettare delicatamente su e giù per separare le cellule. Trasferire le cellule in una provetta conica da 50 mL; Riempire la provetta con il diluente virale.
- Centrifugare a 485 x g per 5 min. Decantare il diluente virale, sostituirlo con un diluente virale fresco da 50 ml e centrifugare a 485 x g per 5 minuti. Decantare il diluente virale e sostituirlo con diluente virale fresco (10 ml/pallone) per risospendere il pellet.
- Utilizzare un emocitometro e il blu di tripano per determinare la conta e la vitalità delle cellule. Regolare la concentrazione cellulare con il diluente virale a 1,5 x 105 cellule/mL.
- Aggiungere 100 μl di cellule MDCK-SIAT1 diluite a ciascun pozzetto delle piastre per microtitolazione (1,5 x 10,4 cellule/pozzetto) e coprire le piastre. Incubare a 37 °C, 5% CO2 per 18 - 20 h.
- Giorno 2: ELISA
- Fissazione delle cellule
- Rimuovere il terreno dalle piastre per microtitolazione. Lavare ogni pozzetto con 200 μL di PBS. Aggiungere 300 μl di acetone freddo all'80% in ogni pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Rimuovere il fissativo e lasciare asciugare le piastre all'aria.
- ELISA
- Addizione di anticorpi primari
nota: L'anticorpo monoclonale anti-influenza A NP deve essere usato in eccesso come anticorpo primario nell'ELISA. Determinare la diluizione ottimale degli anticorpi per ciascun lotto di anticorpi primari eseguendo titolazioni anticorpali in MN. Selezionare la concentrazione di anticorpi primari in eccesso e con il miglior rapporto segnale/fondo.
- Diluire l'anticorpo monoclonale NP anti-influenza A (anticorpo primario) alla concentrazione target nel diluente anticorpale (ad es. aggiungere 30 μl di anticorpo primario a 30 mL di diluente anticorpale per una diluizione target di 1:1000).
- Lavare le piastre 3 volte con 300 μL di tampone di lavaggio. Aggiungere 100 μl di anticorpo primario diluito a ciascun pozzetto. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
- Addizione di anticorpi secondari
NOTA: L'immunoglobulina anti-topo di capra, IgG coniugata alla perossidasi di rafano (HRP) deve essere utilizzata in eccesso come anticorpo secondario nell'ELISA. Determinare la diluizione ottimale degli anticorpi per ciascun lotto di anticorpi secondari eseguendo le titolazioni degli anticorpi. Selezionare la concentrazione di anticorpi secondari in eccesso e con il miglior rapporto segnale/fondo.
- Diluire le IgG di capra anti-topo coniugate all'anticorpo HRP (anticorpo secondario) alla concentrazione target nel diluente anticorpale (ad es. aggiungere 7,5 μL di anticorpo secondario a 30 mL di diluente anticorpale per una diluizione target 1:4000).
- Lavare le piastre 3 volte con 300 μL di tampone di lavaggio. Aggiungere 100 μl di anticorpo secondario diluito a ciascun pozzetto. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
- Aggiunta del substrato e lettura della piastra
- Lavare le piastre 5 volte con 300 μL di tampone di lavaggio e picchiettare su un panno privo di lanugine.
- Aggiungere 100 μl di substrato appena preparato a ciascun pozzetto e incubare a temperatura ambiente fino a quando lo sviluppo del colore non si satura e la densità ottica (OD) dei pozzetti di controllo cellulare <0,2.
- Aggiungere 100 μL di soluzione di arresto a tutti i pozzetti. Leggere il diametro esterno dei pozzetti a 490 nm utilizzando uno spettrofotometro per micropiastre.
- Calcolo TCID 50
- Calcolare il ODmediano 490 dei controlli cella (colonna 12).
- Considerare come "positivo" qualsiasi pozzetto di test con un OD490 maggiore del doppio dell'ODmediano dei pozzetti CC; in caso contrario, è considerato "negativo".
- Calcola il TCID50 del virus utilizzando il metodo Reed-Muench.
- Determinare il numero di positivi e negativi ad ogni diluizione.
- Calcola il "positivo cumulativo", il "negativo cumulativo", il "rapporto" e la "% positiva" come illustrato nella Tabella 1.
- Calcolare la "distanza proporzionale" tra la diluizione che mostra >50% positivi e la diluizione che mostra <50% positivi utilizzando quanto segue:
nota: Il fattore di correzione per la diluizione di 1/2 log è 0,5. Ad esempio, nella Tabella 1: (80 − 50)/(80 − 20) x 0,5 = 0,25
- Calcolare il TCID del virus50 sommando la distanza proporzionale alla diluizione che mostra > 50% positivo.
nota: Ad esempio, nella Tabella 2, TCID50 è 10-5+(-0,25) = 10-5,25. NOTA: questo è il TCID50 del virus per 100 μL (o 10-5,25/100 μL).
- Calcolare la diluizione del virus. Per i saggi MN, diluire il virus a 200 TCID50/100 μL (equivalenti a 100 TCID50/50 μL per pozzetto).
nota: Nell'esempio nella Tabella 1, 1 TCID50 è 10-5,25 in 100 μL e la diluizione per ottenere 200 TCID50/100 μL è 1:891 in base ai calcoli: 200 x 10-5,25 = 10-2,95 = 1/102,95 = 1/891
5. Saggio MN utilizzando le cellule MDCK-SIAT1
- Giorno 1: Test e controllo della preparazione dei sieri e disposizione delle piastre
- Scongelare i sieri in un bagno d'acqua a 37 °C e rimuoverli subito dopo lo scongelamento. Aliquotare la quantità di sieri che deve essere analizzata; per eseguire il test con un virus in singoletto sono necessari almeno 10 μL di siero originale. Se possibile, testare i sieri in duplicati.
- Il calore inattiva i sieri umani per 30 minuti in un bagno d'acqua a 56 °C come al punto 1.12.1. Posizionare i sieri sul ghiaccio dopo l'inattivazione del calore e aggiungere il diluente virale ai sieri per ottenere una pre-diluizione 1:10.
- Trattare e pre-diluire i sieri animali con RDE a 1:10 da utilizzare per i controlli secondo 1.12.2.
nota: I sieri umani e animali scongelati e trattati possono essere conservati a 4 °C per non più di 24 ore. I sieri devono essere conservati congelati a una temperatura di -20 °C o inferiore se è necessario un periodo di conservazione più lungo prima del saggio.
- Per eseguire il test con un virus, aggiungere 100 μl di sieri diluiti 1:10 alle colonne da A1 a A10 (Figura 3). Aggiungere 50 μl di diluente virale alle righe da B a H, ad eccezione delle colonne 11 e 12 (Figura 3). Eseguire una diluizione seriale di 2 volte dalle file A a H e scartare gli ultimi 50 μl alla riga H (Figura 3).
nota: Quando si devono testare più virus, i sieri possono essere diluiti in provette titolate. La diluizione del siero, per determinare il titolo sierico, nel pozzetto A è 1:10, nel pozzetto B 1:20, nel pozzetto C 1:40, nel pozzetto D 1:80, nel pozzetto E 1:160, nel pozzetto F 1:320, nel pozzetto G 1:640, nel pozzetto H 1:1.280 (Figura 3).
- Per il controllo del virus, aggiungere 50 μl di diluente virale ai pozzetti A12, B12, C12 e D12 (senza sieri). Per il controllo cellulare, aggiungere 100 μL di diluente virale ai pozzetti E12, F12, G12 e H12 (nessun virus, nessun sieri).
- Per i sieri di controllo (ad esempio, i controlli dei sieri di furetto), aggiungere 100 μl di sieri di controllo diluiti alla colonna 11 del pozzetto A e aggiungere 50 μl di diluente virale ai pozzetti B11 - H11. Diluire in serie.
- Coprire le piastre e incubare a 37 °C, 5% di CO2 fino al momento dell'aggiunta del virus.
- Giorno 1: Aggiunta del virus
- Diluire il virus a 100 TCID50/50 μL con diluente virale.
- Aggiungere 50 μl di virus diluito a tutti i pozzetti, ad eccezione della colonna 11 sulle piastre di titolazione posteriore (BT) e dei pozzetti di controllo cellulare E12, F12, G12 e H12 su tutte le piastre (Figura 3). Per le piastre con sieri di controllo nella colonna 11, aggiungere il virus alla colonna 11.
- Titolazione in retromarcia (BT)
- Includere un BT nella colonna 11 di una serie di lastre duplicate (ad esempio, piastre 1A e 1B). Aggiungere 50 μl di diluente virale a tutti i pozzetti della colonna 11. Aggiungere 50 μL del virus a 100 TCID50/50 μL al primo pozzetto (A11). Miscelare pipettando su e giù.
- Miscelare e trasferire 50 μl in pozzetti successivi per eseguire diluizioni seriali di 2 volte. Sostituire i puntali delle pipette tra i pozzetti per evitare il trasporto del virus. Scartare 50 μl dal pozzetto H11.
- Aggiungere 50 μl di diluente virale alla colonna 11 per portare il volume finale a 100 μl. Picchiettare le piastre per mescolare.
- Incubare le piastre a 37 °C, 5% CO2 per 1 ora.
- Eseguire l'aggiunta di cellule MDCK-SIAT1 il giorno 1 e l'ELISA il giorno 2 come descritto nei passaggi 4.2 e 4.3 (descritti anche nei punti 5.3 e 5.4)
- Giorno 1: Aggiunta di cellule MDCK-SIAT1
- Preparare le celle MDCK-SIAT1 come descritto al punto 4.2. Aggiungere 100 μL di cellule MDCK-SIAT1 a 1,5 x 105 cellule/mL a ciascun pozzetto (1,5 x 104 cellule/pozzetto). Incubare le piastre a 37 °C, 5% CO2 per 18 - 20 h.
- Giorno 2: ELISA
- Dopo l'incubazione notturna, il secondo giorno, fissare le cellule con acetone freddo all'80% come descritto al punto 4.3.
- Aggiunta di anticorpi primari
- Lavare le piastre 3 volte con 300 μL di tampone di lavaggio. Diluire l'anticorpo monoclonale NP anti-influenza A (anticorpo primario) alla concentrazione ottimale determinata mediante titolazione in diluente anticorpale (ad es. aggiungere 30 μL di anticorpo primario a 30 mL di diluente anticorpale per una diluizione target di 1:1000).
NOTA: Sono necessari 100 μl di anticorpo primario per pozzetto. Sono necessari ~10 mL per piastra.
- Aggiungere 100 μl di anticorpo primario diluito a ciascun pozzetto. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
- Aggiunta di anticorpi secondari
- Lavare le piastre 3 volte con 300 μL di tampone di lavaggio. Diluire le IgG di capra anti-topo coniugate all'anticorpo HRP (anticorpo secondario) alla concentrazione target nel diluente anticorpale (ad es. aggiungere 7,5 μL di anticorpo secondario a 30 mL di diluente anticorpale per un target 1:4000).
NOTA: Sono necessari 100 μL di anticorpo secondario per 96 pozzetti. Sono necessari ~10 mL per piastra.
- Aggiungere 100 μl di anticorpo secondario diluito a ciascun pozzetto. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
- Aggiunta del substrato e lettura della piastra
- Lavare le piastre 5 volte con 300 μL di tampone di lavaggio e picchiettare sulla salvietta priva di lanugine.
- Aggiungere 100 μl di substrato appena preparato a ciascun pozzetto e incubare a temperatura ambiente fino a quando i pozzetti di controllo del virus raggiungono un OD490 = 0,8 - 3, con il controllo cellulare a un basso fondo OD490 <0,2.
- Aggiungere 100 μl della soluzione di arresto a tutti i pozzetti. Leggere il diametro esterno dei pozzetti a 490 nm utilizzando uno spettrofotometro per micropiastre.
- Analisi dei dati
nota: I calcoli MN sono determinati individualmente per ogni lastra.
- Determinare il titolo di anticorpi neutralizzanti di ciascun campione di siero.
- Calcolare il cut-off OD490 del 50% di neutralizzazione del virus per ciascuna piastra utilizzando la seguente equazione:
nota: Qui x = 50% del cut-off di neutralizzazione. La diluizione reciproca del siero corrispondente alla diluizione più alta con OD490 inferiore al 50% del cut-off (inibizione del ≥50%) è considerata il titolo anticorpale di neutralizzazione per quel campione di siero (Figura 4).
- Verificare che i pozzetti di controllo cellulare abbiano un OD490 <0,2 e che i pozzetti di controllo del virus abbiano un OD490 = 0,8 - 3.
- Verificare l'infettività del virus in ogni test (100x TCID50) da parte del virus BT. L'intervallo accettabile di BT è 50, 100 o 200 TCID. Se si utilizza lo stesso cut-off definito al punto 4.4.2, la diluizione massima del virus nella colonna BT con OD superiore al cut-off deve essere nei pozzetti E11, F11 e G11.
nota: I controlli positivi al siero devono dare titoli entro 2 volte i valori ottenuti nei test precedenti. L'OD490 del controllo sierico negativo dovrebbe essere simile a quello osservato per il controllo del virus.
