Un test per rilevare lo scoppio ossidativo nei dischi fogliari di Arabidopsis dopo l'elicitazione immunitaria

Abstract

Fonte: Bredow, M., et al. Saggi di burst ossidativo innescato da pattern e inibizione della crescita della piantina in Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video mostra un test per misurare l'esplosione ossidativa nelle foglie di Arabidopsis dopo l'elicitazione immunitaria. I dischi fogliari, tagliati dalle foglie delle piante, sono incubati con peptidi batterici che funzionano come modelli molecolari associati ai microbi o MAMP. Dopo il rilevamento dei MAMP, le cellule vegetali inducono la produzione di ROS extracellulari, che viene rilevato utilizzando un saggio di chemiluminescenza.

Protocollo

1. Rilevamento dell'esplosione di ROS nei dischi fogliari di Arabidopsis dopo l'elicitazione immunitaria

1. Crescita e mantenimento delle piante.
   1. Per sincronizzare la germinazione, stratificare i semi di Arabidopsis sospendendo circa 50 semi in 1 mL di agar sterile allo 0,1% [p/v] e conservare a 4 °C (senza luce) per 3-4 giorni.
      nota: Stratificare un controllo di fondo wild-type (ad esempio, Col-0) e genotipi con output immunitari alti e bassi (ad esempio, cpk28-1 e bak1-5, rispettivamente) per fungere da controlli interni.
   2. Semina i semi sul terreno e germina in condizioni standard di giornata corta (22 °C, 10 ore di luce, 150 μE/m²/s di intensità luminosa e 65-70% di umidità relativa).
   3. Dopo circa 7 giorni, utilizzare una pinza per trapiantare le singole piantine in nuovi vasi, separate da almeno 4 cm per consentire il pieno sviluppo della rosetta. Trapiantare 6-12 piantine per genotipo e tornare alle condizioni standard di giornata corta. Innaffiare e concimare regolarmente le piante (1 g/L di fertilizzante 20-20-20 ogni 2 settimane).
2. Raccogliere i dischi fogliari in piastre a 96 pozzetti per il recupero notturno.
   1. A 4-5 settimane dalla germinazione (Figura 1A), utilizzare un punzone da biopsia affilato da 4 mm per rimuovere un disco fogliare per pianta, evitando la vena centrale e facendo attenzione a limitare le ferite (Figura 1B). Collocare i dischi fogliari in una piastra luminometrica a 96 pozzetti inutilizzata contenente 100 μl di acqua distillata doppia (ddH₂O) con il lato adassiale rivolto verso l'alto per evitare l'essiccazione (Figura 1C). Se si valutano più elicitori, rimuovere 1 disco fogliare dalla stessa foglia per ogni trattamento con elicitore.
      nota: Foglie campione completamente espanse, dalla terza alla quinta dalla sommità della rosetta, e approssimativamente della stessa dimensione ed età per limitare la variabilità. Se possibile, tagliare i dischi fogliari a metà usando una lama di rasoio prima del recupero notturno, poiché ciò aumenta la superficie esposta alla soluzione di elicitore.
   2. Recuperare per una notte a temperatura ambiente per evitare l'interferenza dei ROS prodotti dalla ferita durante la raccolta del disco fogliare. Coprire le piastre con un coperchio per evitare l'evaporazione.
3. Eseguire il trattamento con elicitore e misurare la produzione di ROS.
   1. Programmare il lettore di piastre prima di aggiungere la soluzione di reazione, in modo da ridurre il tempo che intercorre tra l'inizio della raffica di ROS e le prime misurazioni registrate. Utilizzare un software commerciale appropriato per il lettore di lastre. Nel nostro caso (vedere l'indice), fare clic su Impostazioni e selezionare la cartuccia LUM96 e il tipo di lettura cinetica. Fare clic sulla categoria Area di lettura e trascinare per selezionare un sottoinsieme di pozzetti o l'intera piastra da leggere. Nella scheda PMT e ottica, impostare il tempo di integrazione su 1.000 ms. Nella scheda Temporizzazione, impostare il Tempo di esecuzione totale su 40-60 min e l'Intervallo su 2 min.
   2. Rimuovere l'acqua da ciascun pozzetto utilizzando una pipetta multicanale.
      nota: Non forare i dischi delle foglie, poiché ciò potrebbe causare stress da ferita e comportare uscite ROS più variabili.
   3. Preparare una soluzione di reazione contenente 100 μM di luminolo, 10 μg/mL di perossidasi di rafano (HRP) e la concentrazione desiderata di elicitore (ad esempio: elf18 a 1 nM, 10 nM, 100 nM o 1.000 nM) in ddH₂O sterile utilizzando 10 mL di soluzione per una piastra a 96 pozzetti.
      nota: Sciogliere i peptidi liofilizzati in H₂O sterili in provette a basso legame per ottenere un brodo da 10 mM, congelare in liquido N₂ e conservare a -80 °C. Al momento dell'uso, diluire le scorte in H₂O sterili per generare un materiale di lavoro di 100 μM e conservare a -20 °C.
   4. Utilizzare una pipetta multicanale per erogare 100 μl della miscela di reazione in ciascun pozzetto, aggiungendo contemporaneamente la soluzione a tutti i dischi fogliari dello stesso trattamento. Includere una reazione di controllo (nessun elicitore) per ogni genotipo per valutare i livelli basali di ROS in assenza di elicitazione. Misura immediatamente l'emissione di luce per tutte le lunghezze d'onda dello spettro visibile utilizzando un lettore di micropiastre.
      nota: Preparare e applicare la soluzione di reazione in condizioni di scarsa illuminazione, poiché il luminol e l'HRP sono reagenti sensibili alla luce. Conservare i reagenti in ghiaccio o a -20°C a meno che non vengano utilizzati.
   5. Misurare l'emissione di luce con un tempo di integrazione di 1.000 ms a intervalli di 2 minuti su un periodo di 40-60 minuti in un lettore di micropiastre per catturare il burst ossidativo dinamico (Figura 1D).
      nota: Utilizzare un tempo di integrazione più lungo per migliorare la sensibilità del saggio, garantendo al contempo che tutti i campioni in una piastra a 96 pozzetti possano essere misurati entro un intervallo.

Risultati

Figura 1. Saggio di burst ossidativo a base di luminol dopo induzione immunitaria in Arabidopsis. (A) Coltiva piante sul terreno in condizioni di giornata corta per 4-5 settimane. (B) Utilizzare un punzone per biopsia da 4 mm per raccogliere i dischi fogliari da ciascuna pianta e recuperare durante la notte in ddH2O. (C) Aggiungere la soluzione di reazione (100 μM di luminolo, 10 μg/mL di HR...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
20-20-20 Fertilizzante	Pianta Prod	Codice 10529	Mescolare 1 g/L in acqua e applicare sulle piante ogni 2 settimane per una crescita ottimale.
Punzone per biopsia da 4 mm	Mart medico	232-33-34-P	È possibile utilizzare anche un set di trivella per sughero con una superficie di 0,125 cm^2.
Pipetta multicanale BioHit mLine Mechanical 12 (30-300 uL)	Sartorius	Codice: 725240	È possibile utilizzare qualsiasi pipetta multicanale e, se necessario, una singola pipetta.
elf18 (ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)	EZ Biolab	CP7211	Conservare 10 mM di peptide stock a -80°C in provette a basso legame proteico. Una volta scongelato, conservare 100 uM di materiale lavorante a -20°C.
forcipe	Fisher Scientifico	Codice 22-327379
Perossidasi di rafano	Sigma-Aldrich	P6782	Sciogliere in acqua pura. Conservare a -20°C e al riparo dalla luce.
Luminol	Sigma-Aldrich	Codice: A8511	Dissolvere in DMSO. Conservare a -20°C e al riparo dalla luce.
Sali basali di Murisage e Skoog	Laboratori Cedarlane	MSP09-100LT	Conservare a 4C.
suolo	Orticoltura SunGrow	Mix di sole #1	Altri tipi di terreno possono essere utilizzati anche per coltivare l'Arabidopsis. Mescolare con acqua quando si riempiono le pentole.
Lettore di micropiastre multimodale SpectraMax Paradigm con modulo LUM	Dispositivi molecolari		Per questi saggi è possibile utilizzare qualsiasi lettore di piastre in grado di rilevare la luminescenza.
Piastre a 96 pozzetti in polistirene bianco	Fisher Scientifico	07-200-589