Un test per rilevare lo scoppio ossidativo nei dischi fogliari di Arabidopsis dopo l'elicitazione immunitaria

Abstract

Fonte: Bredow, M., et al. Saggi di burst ossidativo innescato da pattern e inibizione della crescita della piantina in Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video mostra un test per misurare l'esplosione ossidativa nelle foglie di Arabidopsis dopo l'elicitazione immunitaria. I dischi fogliari, tagliati dalle foglie delle piante, sono incubati con peptidi batterici che funzionano come modelli molecolari associati ai microbi o MAMP. Dopo il rilevamento dei MAMP, le cellule vegetali inducono la produzione di ROS extracellulari, che viene rilevato utilizzando un saggio di chemiluminescenza.

Protocollo

1. Rilevamento dell'esplosione di ROS nei dischi fogliari di Arabidopsis dopo l'elicitazione immunitaria

1. Crescita e mantenimento delle piante.
   1. Per sincronizzare la germinazione, stratificare i semi di Arabidopsis sospendendo circa 50 semi in 1 mL di agar sterile allo 0,1% [p/v] e conservare a 4 °C (senza luce) per 3-4 giorni.
      nota: Stratificare un controllo di fondo wild-type (ad esempio, Col-0) e genotipi con output immunitari alti e bassi (ad esempio, cpk28-1 e bak1-5, rispettivamente) per fungere da controlli interni.
   2. Semina i semi sul terreno e germina ....

Risultati

Figura 1. Saggio di burst ossidativo a base di luminol dopo induzione immunitaria in Arabidopsis. (A) Coltiva piante sul terreno in condizioni di giornata corta per 4-5 settimane. (B) Utilizzare un punzone per biopsia da 4 mm per raccogliere i dischi fogliari da ciascuna pianta e recuperare durante la notte in ddH2O. (C) Aggiungere la soluzione di reazione (100 μM di luminolo, 10 μg/mL di HR.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
20-20-20 Fertilizzante	Pianta Prod	Codice 10529	Mescolare 1 g/L in acqua e applicare sulle piante ogni 2 settimane per una crescita ottimale.
Punzone per biopsia da 4 mm	Mart medico	232-33-34-P	È possibile utilizzare anche un set di trivella per sughero con una superficie di 0,125 cm^2.
Pipetta multicanale BioHit mLine Mechanical 12 (30-300 uL)	Sartorius	Codice: 725240	È possibile utilizzare qualsiasi pipetta multicanale e, se necessario, una singola pipetta.
elf18 (ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)	EZ Biolab	CP7211	Conservare 10 mM di peptide stock a -80°C in provette a basso legame proteico. Una volta scongelato, conservare 100 uM di materiale lavorante a -20°C.
forcipe	Fisher Scientifico	Codice 22-327379
Perossidasi di rafano	Sigma-Aldrich	P6782	Sciogliere in acqua pura. Conservare a -20°C e al riparo dalla luce.
Luminol	Sigma-Aldrich	Codice: A8511	Dissolvere in DMSO. Conservare a -20°C e al riparo dalla luce.
Sali basali di Murisage e Skoog	Laboratori Cedarlane	MSP09-100LT	Conservare a 4C.
suolo	Orticoltura SunGrow	Mix di sole #1	Altri tipi di terreno possono essere utilizzati anche per coltivare l'Arabidopsis. Mescolare con acqua quando si riempiono le pentole.
Lettore di micropiastre multimodale SpectraMax Paradigm con modulo LUM	Dispositivi molecolari		Per questi saggi è possibile utilizzare qualsiasi lettore di piastre in grado di rilevare la luminescenza.
Piastre a 96 pozzetti in polistirene bianco	Fisher Scientifico	07-200-589