Misurazione dell'inibizione immuno-indotta della crescita delle piantine

Abstract

Fonte: Bredow, M. et al., Saggi di burst ossidativo innescato da pattern e inibizione della crescita della piantina in Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (147),(2019).

Questo video mostra il saggio di inibizione della crescita delle piantine nella pianta di Arabidopsis thaliana. Viene determinato l'impatto dell'aumento della concentrazione dell'elicitore del peptide immunitario sulla crescita delle piantine.

Protocollo

1. Saggio di inibizione della crescita della piantina

1. Sterilizzare i semi e seminare su piastre Murashige e Skoog (MS).
   1. Preparare un terreno sterile a mezza resistenza (0,5x) MS (2,16 g/L) contenente lo 0,8% di agar [p/v]. Versare il fluido in piastre (90 x 15 mm) in una cappa a flusso laminare.
   2. Sterilizzare circa 100 semi in una provetta da microcentrifuga lavandoli con 1 mL di etanolo al 70% per 2 minuti e rimuoverli per aspirazione. Aggiungere 1 mL di candeggina al 40% e agitare delicatamente per 17 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la candeggina mediante aspirazione e lavare tre volte in 1 ml di acqua sterile per 5 minuti. Risospendere in 1 mL di agar.
      nota: In alternativa, utilizzare un protocollo di sterilizzazione delle sementi con cloro gassoso24.
   3. Seminare circa 100 semi per genotipo su piastre di agar MS utilizzando una pipetta e sigillare con nastro microporoso in una cappa a flusso laminare.
      nota: Evita di posizionare i semi nelle immediate vicinanze in quanto ciò renderà difficile il trapianto di piantine in seguito.
   4. Stratificare i semi posizionando le piastre a 4 °C (senza luce) per 3-4 giorni per sincronizzare la germinazione (Figura 1A).
2. Trapiantare le piantine in piastre a 48 pozzetti contenenti peptidi elicitori immunitari.
   1. Dopo la stratificazione, spostare le piastre alla luce in condizioni di giornata corta (22 °C, 10 ore di luce, 150 μE/m²/s di intensità luminosa e 65-70% di umidità relativa) per 3-4 giorni per consentire la germinazione.
   2. In una cappa a flusso laminare, preparare le diluizioni del peptide dell'elicitore (0 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM e 1.000 nM) in terreni liquidi sterili 0,5x MS contenenti l'1% di saccarosio [p/v], utilizzando 25 mL di MS per ogni piastra a 48 pozzetti. Preparare le piastre pipettando 500 μl di terreno liquido MS o di terreno MS contenente peptidi per pozzetto. Se disponibile, utilizzare un pipettatore ripetuto per la preparazione della piastra per accelerare il processo.
      nota: Per ogni genotipo, coltiva piantine in SM senza elicitore per tenere conto di eventuali differenze intrinseche nella crescita delle piantine.
   3. Usando una pinza sterile, trapiantare con cura una piantina in ogni pozzetto della stessa dimensione ed età, assicurandosi che non vi siano danni alla piantina o rotture alla radice e che la radice sia immersa nel terreno. Per ogni genotipo, trapiantare un minimo di 6-8 piantine in ogni diluizione peptidica (Figura 1B).
      nota: Trapiantare le piantine a 4 giorni dalla germinazione, poiché le radici corte sono più facili da manipolare e le piantine più vecchie possono produrre risultati meno ottimali.
   4. Sigillare le piastre con nastro microporoso e tornare alla luce in condizioni standard di giornata corta (22 °C, 10 ore di luce, 150 μE/m²/s di intensità luminosa e 65-70% di umidità relativa). Lascia che le piantine crescano per 8-12 giorni.

2. Determina l'inibizione percentuale della crescita.

1. Rimuovi con cura le piantine dalle piastre a 48 pozzetti e asciugale tamponandole su un tovagliolo di carta. Pesare le piantine su una bilancia analitica e registrare i valori. Se disponibile, utilizzare una bilancia analitica dotata di uscita USB per registrare i valori di peso fresco su un foglio di calcolo. Prima di pesare le piantine, scatta una foto per mostrare visivamente l'inibizione della crescita (Figura 1C).
2. Determinare la percentuale di inibizione della crescita delle piantine trattate con elicitore rispetto alle piantine coltivate in SM solo come segue:
   
3. Traccia i dati utilizzando un grafico a barre con barre di errore standard o utilizzando un grafico a scatola e baffi per visualizzare meglio la varianza inter-sperimentale.

Risultati

Figura 1. Saggio di inibizione della crescita della piantina indotta da elicitore in Arabidopsis. (A) Semina le piantine su MS agar e cresci per 3-4 giorni in condizioni standard di giornata corta. (B) Trapiantare piantine in piastre a 48 pozzetti contenenti terreno MS o MS contenenti diverse concentrazioni di elf18. (C) Dopo 8-12 giorni, valutare visivamente le dimensioni della piantina e q...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastre sterili a 8 pozzetti con coperchio	Sigma-Aldrich	CLS3548
Bilancia analitica con bozza Sheid	VWR	VWR-225AC	Per i saggi di inibizione della crescita è possibile utilizzare qualsiasi scala analitica standard, tuttavia è ottimale un output diretto al computer.
Pipetta multicanale BioHit mLine Mechanical 12 (30-300 uL	Sartorius	Codice: 725240	È possibile utilizzare qualsiasi pipetta multicanale e, se necessario, una singola pipetta.
elf18 (AcSKEKFERTKPHVNVGTIG)	EZ Biolab	CP7211	Conservare 10 mM di peptide stock a -80 gradi C in provette a basso legame proteico. Una volta scongelato, conservare 100 uM di materiale funzionante a -20 gradi C.
Sali basali di Murisage e Skoog	Laboratori Cedarlane	MSP09-100LT	Conservare a 4 gradi C.
Piastre a 96 pozzetti in polistirene bianco	Fisher Scientifico	07-200-589