NOTA: Il protocollo è applicabile a diversi tessuti vegetali. In questo protocollo sono stati utilizzati dischi di guaina di riso e fogliari per il rilevamento di ROS dopo l'elicitazione PAMP. Poiché le differenze derivano principalmente dal metodo di campionamento, di seguito sono descritte solo le procedure comuni, con passaggi specifici menzionati ove necessario.
1. Preparazione e pretrattamento dei tessuti
- Guaina per riso
- Tagliare la guaina delle piantine di riso di 10 giorni in segmenti di 3 mm con una lama di rasoio affilata o una lama chirurgica per il pretrattamento 1 giorno prima del test ROS (Figura 1B).
- Posizionare cinque segmenti di guaina in un pozzetto singolo di una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti contenente 100 μL di acqua distillata doppia (ddH2O) per 10-12 ore, al buio a 25 °C, che consente la riduzione della perdita di ioni e delle risposte di difesa correlate alla lesione della ferita (Figura 2).
nota: Fare attenzione a mantenere i tagli verticali per garantire una superficie di taglio uniforme esposta alla soluzione di elicitazione è un passo importante per ottenere risultati altamente riproducibili. Muovi delicatamente i segmenti. Non fare tagli o ferite extra sui segmenti, che potrebbero essere fonte di variazione dei dati. In linea di principio, ogni test deve contenere almeno cinque repliche poiché la variazione del valore ROS è grande. Più repliche sono impostate, più affidabili sono i dati.
- Disco fogliare
- Taglia i dischi fogliari (4 mm di diametro) da piante di riso di 4-6 settimane usando un punzone per biopsia con uno stantuffo. Tagliare sempre i dischi fogliari dal terzo centrale della seconda foglia (numerata dall'alto) della fresa principale per ridurre la variazione dei dati (Figura 1C).
- Posizionare un disco fogliare in un pozzetto individuale di una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti contenente 100 μL di ddH2O per 10-12 ore per il pretrattamento, che consente di ridurre le risposte correlate alla ferita in quanto potrebbero interferire con l'induzione dei ROS da parte dei PAMP (Figura 2).
nota: Azionare delicatamente i dischi fogliari. Non praticare tagli o ferite extra sui dischi nell'esperimento, che potrebbero causare variazioni dei dati. L'induzione dei ROS avviene principalmente dalle cellule del bordo tagliato, poiché le superfici dei tessuti del riso (foglie o guaine) sono ricoperte da strati idrofobici. Solo le celle dei bordi tagliati sono a contatto con la soluzione di elicitazione (fare riferimento alla sezione di discussione).
- Mantenere tutti i dischi fogliari galleggianti, con la superficie abassiale rivolta verso l'alto, nei pozzetti di una piastra di microtitolazione per il pretrattamento dell'acqua per evitare variazioni associate al lato fogliare.
2. Preparare la soluzione di elicitazione
- Sciogliere la polvere di L-012 in una soluzione acquosa da 20 mM (6,23 mg/mL) con ddH2O per ottenere la soluzione madre. Quindi, diluire la soluzione madre con 50 mM di tampone Tris HCl (pH 7,5) per ottenere la soluzione di lavoro alla concentrazione finale di 500 μM L-012. Tenere la soluzione madre congelata e diluirla nella soluzione di lavoro prima dell'uso.
- Preparare la soluzione di elicitazione contenente PAMP, L-012 e perossidasi di rafano (HRP; 10 mg/mL in ddH2O). Per una soluzione di elicitazione da 10 mL, miscelare 9,4 mL di 50 mM di soluzione di Tris HCl (pH 7,5), 400 μL della soluzione L-012, 100 μL di HRP e 100 μL di flg22 (PAMP; 10 mM in ddH2O). Per il controllo negativo, aggiungere 100 μL di ddH2O invece di PAMP.
nota: Conservare le soluzioni di elicitazione preparate a temperatura ambiente per evitare stress da freddo sui tessuti del riso. Se necessario, è possibile utilizzare anche altri PAMP per il trattamento, come la chitina (20 ng/mL in concentrazione finale). Poiché L-012 è sensibile alla luce, coprire tutte le provette contenenti la soluzione di L-012 con un foglio di alluminio.
3. Avvio del software e configurazione del protocollo con il lettore di micropiastre di riferimento (vedi Tabella dei materiali)
NOTA: Ci vuole un po' di tempo per impostare i parametri del software del lettore di micropiastre. Si consiglia di preparare la macchina e il protocollo (un clic per procedere) prima di aggiungere la soluzione di elicitazione.
- Avviare il software. Fare clic sul pulsante Esperimenti per creare un nuovo protocollo o utilizzare un protocollo esistente.
- Fare clic su Procedura nel popup per impostare la piastra. Selezionare i pozzetti dalla piastra da monitorare.
- Fare clic su Avvia cinetica per impostare il tempo di esecuzione totale e l'intervallo di lettura. Impostare il tempo di esecuzione su 35 minuti o più, a seconda dei requisiti sperimentali. Per ottenere le letture il più frequentemente possibile, selezionare Intervallo minimo. Per il tempo di integrazione, scegliere 1 s o più, a seconda dell'intensità del segnale.
NOTA: L'intervallo di lettura dipende dal numero di campioni e dalla durata dell'integrazione del segnale.
- Fare clic su Convalida | OK per confermare le impostazioni.
- Fare clic su Rileva la nuova piastra nel pop-up e attendere che il software visualizzi la finestra di dialogo della piastra di carico. Posizionare la piastra da testare sul supporto.
- Fermati qui per attendere che il sistema di elicitazione venga stabilito (nella prossima sezione). Non appena il sistema di elicitazione è pronto, fare clic su Esegui per avviare la lettura.
4. Stabilire il sistema di elicitazione e misurare la produzione di ROS in tempo reale
- Rimuovere con cautela il ddH2O dai pozzetti contenenti i tessuti pretrattati, evitando qualsiasi danno o essiccazione dei tessuti.
- Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 200 μl della soluzione di elicitazione ai pozzetti contenenti i tessuti.
- Agitare delicatamente per mescolare. Fare clic su Esegui per avviare il rilevamento.
nota: Con il trattamento PAMP, i tessuti vegetali rispondono e producono ROS molto rapidamente. Pertanto, si suggerisce di trattare prima il controllo negativo senza PAMP per ridurre il tempo dell'operazione quando ci sono più trattamenti. Operare il più rapidamente possibile per ridurre il ritardo di elicitazione tra i trattamenti. Più breve è il tempo che intercorre tra l'aggiunta della soluzione di elicitazione e l'inizio della rivelazione, migliore sarà l'acquisizione di importanti dati sperimentali.
