Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Isolamento di cellule mononucleate nel sangue periferico
- Ottenere sangue intero umano da un donatore sano o da un paziente tramite venipuntura utilizzando vacutainer contenenti anticoagulante acido-citrato-destrosio (ACD) (provette gialle).
nota: Il sangue intero può essere conservato in ACD a temperatura ambiente (18-22 °C) per un massimo di 36 ore prima di procedere alla fase successiva. Normalmente, per il test sono sufficienti 1-2 provette vacutainer da 10 ml di sangue intero.
- Diluire il sangue intero 1:1 v/v in un terreno RPMI completo caldo (RPMI-1640 integrato con il 10% di siero fetale bovino, 20 mM di HEPES e 0,01 mg/mL di gentamicina).
- Isolare le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) dal sangue intero diluito utilizzando la centrifugazione in gradiente di densità, come raccomandato dal produttore (vedere l'elenco dei materiali). Sovrapporre il sangue diluito molto lentamente sul gradiente di densità (riscaldato a temperatura ambiente, 18-22 °C).
nota: Ridurre al minimo la quantità di miscelazione all'interfaccia per una separazione ottimale del sangue stratificando accuratamente la miscela di sangue in modo goccia a goccia o utilizzando una pipetta.
- Lasciare che la miscela di sangue si sovrapponga lentamente al gradiente di densità posizionando la punta della pipetta vicino al gradiente di densità e lasciando che la miscela di sangue scorra lungo il lato della provetta molto lentamente.
- A seconda della scala dell'esperimento, sovrapporre 10 mL di miscela di sangue sopra 3 mL di gradiente di densità (in una provetta da 15 mL) o strato 35 mL di miscela di sangue sopra 15 mL di gradiente di densità (in una provetta da 50 mL). Tipicamente, 10 ml di sangue intero producono 10 milioni di PBMC, con alcune variazioni da donatore a donatore.
nota: È molto importante che non vi sia miscelazione della miscela di sangue con il gradiente di densità. La miscela di sangue dovrebbe sovrapporsi al gradiente di densità e aumentare lentamente fino a quando tutto il sangue non si trova sopra il gradiente di densità.
- Centrifugare la miscela stratificata a 700 x g per 30 minuti senza freni. La miscela centrifugata deve essere separata in 5 strati (dall'alto verso il basso): plasma, buffy coat (contenente PBMC), materiale a gradiente di densità, granulociti e globuli rossi.
- Rimuovere ed eliminare la maggior parte del plasma e recuperare con cura il contenuto di buffy coat (PBMC) in una nuova provetta da 15 ml utilizzando una pipetta Pasteur e un bulbo di aspirazione.
nota: La rimozione dello strato di buffy coat viene eseguita efficacemente applicando l'aspirazione sulla pipetta Pasteur mentre si esegue un movimento circolare attorno all'esterno dello strato, con la punta della pipetta contro il tubo.
- Lavare le PBMC isolate tre volte in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a pH 7,3 centrifugando a 350 x g per 10 minuti (con freni a fondo) tra un lavaggio e l'altro. Ricostituire il pellet PBMC in mezzo RPMI completo. A seconda delle dimensioni del pellet, sono sufficienti 3-7 ml di terreno.
- Contare la PBMC utilizzando il blu di tripano e un emocitometro. Conta solo quelle cellule che non sono macchiate dal blu di tripano. Ricostituire le PBMC a 1.750.000 cellule/mL in un terreno RPMI completo.
- Seminare 400 μl (700.000 cellule) in ciascun pozzetto di un vetrino a 8 camere. Incubare il vetrino in un incubatore per colture tissutali a 37 °C, completamente umidificato (integrato con CO2 al 5%) per 1 ora per consentire ai monociti/macrofagi di aderire.
2. Pre-trattamento dei monociti aderenti
NOTA: Questo passaggio è necessario solo se si cercano modi per inibire o migliorare la fagocitosi.
- Pretrattare i monociti aderenti con qualsiasi farmaco o composto di interesse. Ricostituire il/i farmaco/i o altro materiale di prova alla concentrazione desiderata utilizzando un mezzo RPMI completo.
nota: Ad esempio, 200 μg/mL di IVIG vengono tipicamente utilizzati per produrre un'inibizione del 95-100% della fagocitosi quando si utilizzano monociti umani.
- Aspirare ed eliminare il surnatante contenente eventuali cellule non aderenti dal vetrino a 8 camere dopo l'incubazione di 1 ora (dopo la fase 1.6). Sostituirlo con 400 μL di un farmaco o di un altro trattamento e incubare per 1 ora a 37 °C.
- Quando si aspirano e si sostituiscono le soluzioni nel vetrino a 8 camere, assicurarsi di controllare il flusso dei fluidi in modo che le cellule debolmente aderenti non si sollevino. Inoltre, lavora con solo 2-3 pozzetti vuoti alla volta ed evita di asciugare i pozzetti.
nota: Tipicamente, ogni trattamento viene eseguito in triplicati tecnici.
3. Opsonizzazione dei globuli rossi R2R2
NOTA: I globuli rossi Opsonizzati R2R2 sono utilizzati come controllo positivo per la fagocitosi mediata da FcγR. Naïve R2R2 deve essere conservato nella soluzione di Alsever (per prolungarne la durata di conservazione) a 4 °C per un massimo di 1 mese. La soluzione di Alsever è prodotta internamente ed è composta da citrato trisodico (diidrato) allo 0,8% p/v, destrosio p/v all'1,9%, cloruro di sodio allo 0,42% p/v e acido citrico (monoidrato) allo 0,05% p/v. Se le cellule R2R2 non sono disponibili, è possibile utilizzare altre cellule fenotipizzate Rh, come R1R2, R1R1, R1r o R2r.
- Lavare i globuli rossi R2R2 (cDE/cDE) in PBS per un totale di tre volte utilizzando la centrifugazione a 350 x g per 5 minuti ciascuno.
nota: La quantità di globuli rossi necessaria dipende dalla dimensione dell'esperimento e può essere calcolata a ritroso. Lavare sempre una quantità eccessiva di globuli rossi, poiché i globuli rossi vengono persi durante ogni lavaggio a causa della lisi o durante la rimozione del surnatante. Ad esempio, in un esperimento con 5 trattamenti e 2 controlli, tutti condotti in triplicati tecnici, si ottiene un totale di 21 pozzi. 21 pozzetti con 400 μL/pozzetto di miscela di globuli rossi all'1,25% indicano che sono necessari 105 μL di globuli rossi opsonizzati impacchettati. 200 μL di globuli rossi devono essere inizialmente lavati e 150 μL devono essere opsonizzati per garantire che vi sia una quantità adeguata di globuli rossi per la fase di fagocitosi.
- Opsonizzare il pellet R2R2 lavato con anticorpi policlonali anti-D 1:1 v/v da siero umano e incubare per 1 ora a 37 °C, con miscelazione intermittente.
nota: Se gli anticorpi policlonali anti-D non sono disponibili, è possibile utilizzare anticorpi monoclonali anti-D, che sono disponibili in commercio, o anti-D che sono normalmente utilizzati per la profilassi immunitaria Rh, che possono essere ottenuti da banche del sangue o servizi trasfusionali. I test di ottimizzazione devono essere condotti all'inizio dell'impostazione del test e ogni volta che si passa a un lotto di anticorpi policlonali non titolati o a un anticorpo monoclonale. Questo serve a identificare la concentrazione o il volume ottimale di anti-D richiesto per un risultato del test antiglobulina (IAT) compreso tra 3+ e 4+ e un risultato della fagocitosi compreso tra 70 e 90 globuli rossi fagocitati per 100 monociti contati.
- Lavare l'Opsonized R2R2 per un totale di tre volte in PBS utilizzando la centrifugazione a 350 x g per 5 min cad.
nota: L'opsonizzazione riuscita di R2R2 può essere confermata eseguendo un IAT indiretto. In breve, vengono aggiunti anticorpi policlonali secondari anti-umani per legare gli anticorpi opsonizzanti primari sulle superfici dei globuli rossi e il segnale amplificato può essere osservato sotto forma di emoagglutinazione. Un protocollo dettagliato del produttore è disponibile nel file dei materiali supplementari.
- Ricostituire il pellet R2R2 lavato all'1,25% v/v utilizzando un mezzo RPMI completo.
nota: L'eccesso di R2R2 opsonizzato può essere conservato nella soluzione di Alsever a 4 °C per un massimo di una settimana.
4. Fagocitosi mediata dal recettore Fc
- Aspirare il farmaco o il surnatante medio dal vetrino a 8 camere e aggiungere 400 μl della miscela all'1,25% v/v R2R2. Incubare a 37 °C per 2 ore.
- Dopo 2 ore di incubazione, rimuovere le camere utilizzando gli adattatori del produttore. Tamponare l'eccesso di R2R2 su un tovagliolo di carta. Assicurarsi che il vetrino non si asciughi.
- Riempire un becher da 100 ml con PBS. Immergere e lavare il vetrino muovendolo lentamente avanti e indietro (circa 30-40 colpi) per rimuovere la maggior parte dei vetrini non fagocitati R2R2.
- Rimuovere il vetrino dal PBS. Tampona il PBS in eccesso usando un tovagliolo di carta o un fazzoletto e asciuga il vetrino all'aria.
- Fissare il vetrino essiccato all'aria in metanolo al 100% per 45 s. Quindi, asciugare all'aria il vetrino fisso.
nota: I vetrini possono essere fissati utilizzando un altro metodo più compatibile con la colorazione a valle, come il colorante di Grünwald-Giemsa21 o il colorante di Wright-Giemsa.
- Montare la guida utilizzando un mezzo di montaggio Elvanol prodotto internamente (o un altro mezzo di montaggio disponibile in commercio) e aggiungere i vetrini.
nota: Il mezzo di montaggio Elvanol è composto per il 15% p/v da resina di alcool polivinilico e per il 30% da glicerina v/v in PBS. La miscela viene riscaldata fino a quando tutta la resina si è dissolta e la glicerina è miscelata in modo omogeneo. Questo può essere sostituito con altri mezzi di montaggio disponibili in commercio.
- Lasciare asciugare la montatura per una notte prima della quantificazione.
5. Quantificazione della fagocitosi
- Utilizzando un microscopio a contrasto di fase e una lente obiettivo 40X, quantificare manualmente la quantità di eventi fagocitici contando almeno 200 monociti e il numero di R2R2 fagocitati all'interno di questi monociti. Avere un contatore in ogni mano per quantificare contemporaneamente il numero di monociti e il numero di fagocitati R2R2.
- Ottenere l'indice fagocitario medio dividendo il numero di fagocitati R2R2 per il numero di monociti e moltiplicando per 100. Esprimere i dati come media (indice fagocitario medio) ± l'errore standard della media (SEM).
