1. Prepara i reagenti e i materiali necessari
- Preparare soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente il 2% di siero fetale bovino (FBS) ("tampone di lavaggio"). Preparare il PBS con siero fetale di vitello al 2% (FCS) contenente lo 0,1% di detergente non ionico ("tampone per il lavaggio permanente"; vedere la Tabella dei materiali). Preparare il PBS con formaldeide all'1,5%
nota: La formaldeide è corrosiva e potenzialmente cancerogena e deve essere maneggiata indossando adeguati dispositivi di protezione individuale.
- Preparare PBS contenente il 2% di FBS e 0,5 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) per la separazione magnetica delle cellule ("tampone MCS").
- Preparare 50 μg/mL di isotiocianato di falloidina-fluoresceina (falloidina-FITC) in dimetilsolfossido (DMSO). Preparare un colorante nucleare da 1 mg/mL (ad es. 1 mg/mL di 7-amminomicina D (7-AAD) in DMSO o colorante bis-benzimmide; vedere la Tabella dei materiali) in DMSO. Preparare gli anticorpi marcati con fluorocromo appropriati per le cellule di interesse e il citometro a flusso per immagini.
- Ottenere tessuti animali (ad esempio, linfonodi e milza) come fonte di cellule T e tessuti animali allogenici (ad esempio, milza e midollo osseo) come fonte di cellule presentanti l'antigene o progenitori.
- Preparare il terreno di coltura cellulare (ad esempio, il terreno del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 o il Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) integrato con il 10% di FBS), 50 μM di 2-mercaptoetanolo, penicillina e streptomicina e ottenere piastre per colture cellulari a 24 e/o 96 pozzetti.
2. Prepara le cellule presentanti l'antigene (APC)
NOTA: In teoria, qualsiasi popolazione APC potrebbe essere esaminata con questo metodo. In questo caso sono state citate in giudizio cellule dendritiche (DC) derivate dal midollo osseo di topo immature come APC. Esistono molti protocolli per generare queste cellule. In breve, è stato utilizzato il seguente protocollo.
- Sciacquare il midollo da femori e tibie in RPMI 1640 o DMEM.
- Passare le cellule sospese attraverso un colino cellulare da 70 μm per rimuovere piccoli pezzi di osso e detriti.
- Pellettare le cellule mediante centrifugazione e quindi lisare i globuli rossi utilizzando un tampone di cloruro di ammonio per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Pellettare le celle mediante centrifugazione (400 x g, 5 min) e risospendere il pellet della cella.
- Lavare le celle in 5 - 10 mL di tampone di lavaggio, pellettare per centrifugazione (400 x g, 5 min) e risospendere il pellet della cella.
- Arricchire i precursori ematopoietici su una colonna di separazione cellulare marcando le cellule con anticorpi biotinilati anti-CD3 (5 μg/mL), anti-B220 (5 μg/mL), anti-MHC di classe II (1 μg/mL) e anti-CD11b (5 μg/mL).
- Pellettare le celle mediante centrifugazione (400 x g, 5 min) e risospendere il pellet della cella.
- Incubare le cellule con microsfere magnetiche anti-biotina (vedere la Tabella dei materiali) a 4 °C per 10 minuti.
- Lavare e pellettare le cellule (400 x g, 5 min) e risospenderle in 1 mL di tampone MCS prima di rimuovere le cellule marcate utilizzando una colonna di separazione cellulare magnetica a selezione positiva (LS) di grandi dimensioni innescata con 3 mL di tampone MCS e inserita nel suo magnete. Lavare la colonna 3 volte con 3 mL di tampone MCS; Il flusso conterrà le celle desiderate.
- Coltura delle cellule che passano attraverso la colonna per 6 giorni in RPMI 1640 o DMEM integrati con 2 ng/mL di fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi ricombinanti di topo (GM-CSF) e 2 ng/mL di fattore di crescita trasformante umano ricombinante β1 (TGFβ1). Sostituire metà del terreno ogni 2 giorni con un terreno completo fresco contenente 2 ng/mL GM-CSF e TGFβ1.
NOTA: Il TGFβ1 umano ha attività nelle cellule di topo. I dati sono stati generati utilizzando questi DC immaturi. Altre cellule (ad esempio, cellule B e DC mature) possono essere adatte come APC ma non sono state testate in questo test.
- Crioconservare le DC in 90% siero/10% DMSO e conservare in azoto liquido; recuperare il giorno dell'uso. Prima dell'uso, contare il numero di DC vitali in un emocitometro utilizzando l'esclusione del blu di tripano. Risospendere il pellet cellulare nel terreno di coltura alla densità appropriata (vedere il passaggio 4.1) prima dell'uso nel paragrafo 4.
3. Prepara le cellule T
- Utilizzare metodi di selezione negativa per evitare di trasmettere inavvertitamente segnali attivanti o inibitori alle cellule.
NOTA: In questo esempio, le cellule T CD4+ vengono preparate per l'analisi.
- Per preparare le cellule T CD4+ dalla milza di topo, schiacciare la milza attraverso un colino cellulare da 70 μm utilizzando lo stantuffo di una siringa. Lavare il filtro cellulare con il tampone di lavaggio.
- Pellettare le celle sospese mediante centrifugazione (400 x g, 5 min) e quindi lisare i globuli rossi rimettendo in sospensione il pellet in un tampone di cloruro di ammonio per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Pellettare le celle mediante centrifugazione (400 x g, 5 min) e risospendere il pellet.
- Lavare le celle in 5 - 10 mL di tampone di lavaggio e pellet mediante centrifugazione (400 x g, 5 min). Risospendere il pellet.
- Colorare le cellule con anticorpi biotinilati contro CD8, complesso maggiore di istocompatibilità di classe II (MHC II, 1 μg/mL) e CD19 (5 μg/mL). Incubare per 10 minuti a 4 °C.
- Lavare le cellule in 10 mL di tampone di lavaggio e pellet mediante centrifugazione (400 x g, 5 min). Risospendere il pellet.
- Incubare le cellule con microsfere magnetiche anti-biotina (vedere la Tabella dei Materiali) secondo le indicazioni del produttore.
- Lavare le celle in 10 mL di tampone di lavaggio e pellet per centrifugazione (400 x g, 5 min); risospendere il pellet.
- Risospendere le cellule in 1 mL di tampone MCS e arricchire le cellule T CD4+ su una colonna di separazione cellulare magnetica innescata con 3 mL di tampone MCS su un magnete. Lavare la colonna 3 volte con 3 mL di tampone MCS. Il flusso passante della colonna conterrà le cellule T arricchite.
- Mediante citometria a flusso standard, valutare la purezza delle cellule T utilizzando un'aliquota delle cellule selezionate negativamente. Colorare le cellule utilizzando un coniugato fluorocromo-streptavidina (per identificare eventuali cellule marcate con biotina che avrebbero dovuto essere rimosse sulla colonna) e uno o più anticorpi per identificare la popolazione di cellule T di interesse (CD4 in questo caso); Una purezza del ≥85% è accettabile.
- Contare le cellule T in un emocitometro mediante esclusione del blu di tripano (≥la vitalità del 90% è accettabile).
NOTA: Il tampone MCS contiene EDTA, che deve essere rimosso prima del saggio. A tale scopo, pellettare le cellule mediante centrifugazione (400 x g, 5 min) e lavarle in 1 mL di tampone di lavaggio. Pellettare nuovamente le cellule (400 x g, 5 min) e risospenderle in terreno di coltura alla densità appropriata (vedere la fase 4.1).
4. Co-incubazione di cellule T e DC
- Semina di cellule T e DC con un rapporto T:DC di 2:1 in una piastra di coltura cellulare a 24 o 96 pozzetti. Assicurarsi che il volume di coltura finale sia di ≤500 μl per piastre a 24 pozzetti o di ≤50 μl per piastre a 96 pozzetti.
NOTA: I volumi più piccoli incoraggiano le interazioni cellula-cellula e lasciano spazio per i successivi tamponi di fissaggio.
- Regolare il numero preciso di cellule in modo empirico, ma come guida generale, utilizzare 1 x 106 cellule T e 0,5 x 106 DC per pozzetto (piastra a 96 pozzetti). Questi dovrebbero essere considerati il numero minimo di cellule perché l'utilizzo di meno cellule rende difficile l'enumerazione delle sinapsi immunitarie.
- Per aumentare il numero di cellule, impostare pozzetti di replica e pool dopo il passaggio 5 (fissazione).
NOTA: Quando si impostano pozzetti replicati, è consigliabile seminare prima le DC in tutti i pozzetti e poi seminare le cellule T in tutti i pozzetti; Ciò riduce al minimo le discrepanze nel tempo di incubazione tra i pozzetti.
- Incubare la piastra per 4 ore a 37 °C in un'atmosfera di CO2 al 5%.
5. Correggi le Celle nella Piastra
- Aggiungere 3 volte il volume di coltura di formaldeide all'1,5% in PBS a ciascun pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti; è importante fissare le cellule prima di rimuoverle dalla piastra per ridurre al minimo l'interruzione delle interazioni cellula-cellula.
- Trasferire le celle nella piastra in tubi per il successivo lavaggio e colorazione. In questa fase, mettere da parte celle aggiuntive per i controlli di una singola colorazione. Oltre a questi controlli, l'intera coltura deve essere colorata con il cocktail di anticorpi (vedere passaggio 4.1.1).
6. Cellule di macchia
- Colorare le cellule in 100 μL di tampone di lavaggio contenente un cocktail degli anticorpi coniugati al fluorocromo desiderati per 30 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
NOTA: Il cocktail include anticorpi specifici per le cellule T e specifici per APC. I fluorocromi devono essere scelti in modo tale da poter essere distinti utilizzando la configurazione del citometro a flusso per immagini. Negli esperimenti mostrati qui, sono stati utilizzati CD11b coniugato con fluorofori blu (5 μg/mL, vedi la Tabella dei materiali) e CD90.2 coniugato con APC (5 μg/mL).
- Lavare le cellule in 1 mL di tampone di lavaggio e centrifugare per 5 minuti a 400 x g. Decantare il surnatante. Risospendere le cellule in tampone di lavaggio permanente contenente falloidina FITC a 0,05-0,5 μg/mL e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce.
NOTA: Le concentrazioni di falloidina FITC di circa 0,1 μg/mL funzionano bene per le cellule di topo, ma si prevede che la concentrazione appropriata vari in base al fornitore, al tipo di cellula e al citometro a flusso per immagini.
- Lavare le cellule in 1 mL di tampone permanente/lavaggio e centrifugare per 5 minuti a 400 x g. Decantare il surnatante. Risospendere le cellule in tampone permanente/di lavaggio contenente colorante nucleare alla concentrazione appropriata (ad esempio, circa 25 μg/mL di 7-AAD) e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce.
- Lavare le cellule in 1 mL di tampone permanente/lavaggio e centrifugare per 5 minuti a 400 x g. Decantare il surnatante. Lavare le celle una volta in tampone di lavaggio, pellet e risospendere in 50 - 100 μl di tampone di lavaggio, trasferendo le celle in piccole provette da microcentrifuga tappate.
- Procedere immediatamente all'acquisizione dei dati o conservare le cellule a 4 °C al riparo dalla luce per un massimo di diversi giorni prima dell'acquisizione sul citometro a flusso per immagini.
NOTA: Le cellule sono state conservate con successo in questo modo per un massimo di 7 giorni. Potrebbe essere possibile una conservazione più lunga, ma non è stata testata.
7. Acquisisci dati
- Inizializzare e configurare il citometro a flusso con imaging secondo le istruzioni del produttore. Garantire la stabilità del nucleo di flusso prima di raccogliere qualsiasi dato.
- Riserva un canale per l'acquisizione di immagini in campo chiaro. Acquisisci i dati di controllo di una singola macchia con il canale del campo chiaro disattivato.
- Fare clic sul pulsante "Carica" e inserire una provetta contenente un campione completamente colorato (un campione che è stato colorato con tutti i fluorocromi necessari) nel supporto.
- Nella finestra "area di lavoro", selezionare e creare un nuovo grafico a dispersione con le proporzioni sui singoletti di area e gate in cui le proporzioni sono vicine a 1. Crea un nuovo grafico a dispersione per ogni canale utilizzato (intensità del canale sull'asse orizzontale).
- Per ogni fluorocromo, controllare la popolazione positiva e, se necessario, regolare la tensione laser nella casella "Illuminazione".
- Scaricare il tubo e caricare il primo tubo macchiato singolarmente.
- Nella casella "Impostazioni di acquisizione", digitare il nome del campione e impostare il numero di eventi che devono essere raccolti; se si tratta di una singola macchia (per i controlli di compensazione), sono sufficienti 1.000 - 2.000 eventi.
- Nella casella "Canali", selezionare i canali con cui ogni campione è stato colorato. Per i controlli a macchia singola, tutti i canali devono essere selezionati con il campo chiaro e la dispersione laterale disattivati. Fare clic sul pulsante "Registra" sotto la casella "Acquisizione"; Quando il numero di eventi raggiunge la soglia specificata, l'acquisizione si interrompe automaticamente.
- Fare clic sul pulsante "Restituisci" per scaricare il tubo. Ripetere i passaggi 7.2.4 - 7.2.6 per ogni controllo a macchia singola. A seconda del citometro e del software, potrebbe non essere possibile impostare tutti i gate mostrati nella Figura 1 durante l'acquisizione (durante l'analisi viene eseguito un gating più preciso; vedere la sezione 8).
- Acquisire i campioni come per i campioni colorati singolarmente (al punto 7.2), ma nella casella "Canali" selezionare tutti i canali richiesti, incluso il canale in campo chiaro.
- Prima di registrare i dati, verificare che l'intensità del canale sia appropriata per identificare le popolazioni cellulari desiderate. In caso contrario, regolare le impostazioni del laser e registrare nuovamente i controlli di una singola macchia utilizzando le nuove impostazioni, come descritto al punto 7.2.
- Per ogni campione, acquisire diverse decine di migliaia di eventi.
nota: Nella maggior parte delle condizioni, gli eventi di contatto cellula-cellula sono una piccola minoranza del numero totale di cellule (la maggior parte sono cellule singole). In generale, è auspicabile avere almeno 100 eventi nel gate di contatto finale della membrana.
