Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione
- Liquido di lavaggio
- Preparare una soluzione salina bilanciata con acido etilendiamminotetraacetico 100 μM (EDTA).
nota: Per misurare i livelli di proteine nel liquido di lavaggio broncoalveolare (BAL), si raccomanda di aggiungere inibitori della proteasi per prevenire l'attività della proteasi nel liquido BAL.
- catetere
- Realizzare un catetere inserendo un ago da 23 G in un tubo di plastica trasparente in polietilene da 21 G (diametro interno: 0,58 mm, diametro esterno: 0,965 mm e lunghezza: 0,5 cm). È possibile utilizzare anche cateteri prefabbricati.
- Anestetici
- Preparare un anestetico terminale, preferibilmente uno che provochi l'arresto respiratorio (ad esempio, un barbiturico come la soluzione di pentobarbital di sodio (>100 mg/kg) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)).
nota: Si consiglia di utilizzare l'anestesia iniettata invece dell'anestesia inalatoria, poiché l'anestesia inalata può influenzare il contenuto di liquido BAL. La CO2, ad esempio, ha un'influenza sul pH del sangue e di conseguenza sulla ridistribuzione di diversi composti.
- Tampone per lisi dei globuli rossi ammonio-cloruro-potassio (ACK)
- Preparare un tampone di lisi ACK sciogliendo 8,29 g di cloruro di ammonio (NH4Cl) e 1 g di bicarbonato di potassio (KHCO3) in 1 L di H2O con 100 μM di EDTA; il tampone di lisi dei globuli rossi può essere acquistato anche da una fonte esterna.
2. Esecuzione del lavaggio broncoalveolare (BAL)
- Introduzione del catetere nella trachea
- Eutanasia del topo mediante iniezione intraperitoneale di una dose letale di un anestetico barbiturico a breve durata d'azione utilizzando un ago da 26 G. Per confermare la corretta anestesia letale, pizzicare la zampa posteriore del topo con una pinza per controllare il riflesso del piede.
- Posiziona l'animale sulla schiena su una placca chirurgica e fissa il topo bloccando gli arti.
- Spruzzare etanolo al 70% sul collo per disinfettare. Fai un'incisione nella pelle del collo vicino alla trachea usando un bisturi.
- Aprire la pelle per esporre le ghiandole salivari. Separare le ghiandole salivari usando una pinza per esporre il muscolo sternoioide. Incidere il muscolo intorno alla trachea usando una pinza per esporre la trachea.
- Metti un filo di cotone sotto la trachea usando una pinza.
- Perforare con cura il centro della trachea esposta tra due anelli di cartilagine con un ago da 26 G. Fare attenzione a non danneggiare ulteriormente la trachea.
- Inserire il catetere a circa 0,5 cm nella trachea. Assicurarsi che il catetere non sia inserito troppo in profondità nella trachea, poiché ciò può causare danni alla struttura polmonare.
- Stabilizzare il catetere legando la trachea attorno al catetere utilizzando il filo di cotone posizionato al punto 2.1.5. Se il catetere non è legato a sufficienza, la soluzione salina bilanciata iniettata può fluire verso la parte superiore delle vie respiratorie invece che verso il basso nei polmoni.
- Raccogliere il liquido di lavaggio
- Caricare una siringa da 1 mL con 1 mL di soluzione salina bilanciata sterile con 100 μM di EDTA.
- Collegare la siringa da 1 ml al catetere e iniettare delicatamente la soluzione di sale/EDTA nel polmone.
- Aspirare delicatamente la soluzione massaggiando il torace del topo. Se il liquido aspirato non è visibile nella siringa, inserire con cautela il catetere un po' più in basso o su per la trachea.
- Estrarre la siringa dall'ago e trasferire il liquido di lavaggio recuperato in una provetta da 15 ml posta su ghiaccio. Normalmente, 700 - 900 μL di BAL vengono recuperati da 1 mL di soluzione iniettata.
- Ripetere i passaggi 2.2.1 - 2.2.4 altre due volte.
nota: Se lo scopo è quello di analizzare il contenuto non cellulare, si consiglia di concentrare i campioni raggruppati quando ci sono problemi di sensibilità.
3. Raccolta dei componenti cellulari e non cellulari del fluido BAL
- Centrifugare il liquido di lavaggio per 7 minuti a 400 x g e 4 °C.
- Raccogliere il surnatante e utilizzarlo immediatamente per ulteriori analisi (ad esempio, saggio di immunoassorbimento enzimatico, ELISA) o congelare a -80 °C. Conservare il pellet cellulare per analizzare l'afflusso cellulare nei polmoni.
- Risospendere il pellet cellulare in 200 μl di tampone di lisi ACK.
nota: Questo passaggio garantisce la lisi degli eritrociti mantenendo intatti i globuli bianchi.
- Incubare per 2 minuti a RT.
nota: Per ridurre la variazione causata dalla lisi dei globuli rossi, questo passaggio non deve essere eseguito per più di 2 minuti.
- Aggiungere 1 mL di PBS freddo per diluire il tampone di lisi ACK.
- Centrifugare per 7 minuti a 400 x g e 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in un volume adeguato di PBS per l'analisi a valle (vedere sotto).
nota: Il volume del PBS dipende dallo studio a valle che verrà eseguito.
4. Analisi dei diversi tipi di cellule nel fluido BAL mediante citometria a flusso
NOTA: Una possibilità è quella di analizzare la composizione cellulare assoluta e relativa del fluido BAL eseguendo la citometria a flusso. L'obiettivo di questo articolo è quello di approfondire la tecnica della BAL. La citometria a flusso è una tecnica specializzata di per sé. Si consiglia di leggere articoli specializzati sulla tecnica della citometria a flusso. Vengono utilizzati anticorpi accoppiati a un fluoroforo che riconoscono antigeni di superficie (vedi Tabella 1) specifici per un particolare tipo di cellula. Utilizzando una strategia di gating, è possibile identificare le cellule T, i macrofagi, le cellule dendritiche, le cellule B, gli eosinofili e i neutrofili nella frazione cellulare del BAL.
- Colorazione della superficie cellulare
nota: È importante includere tutti i controlli critici per l'analisi della citometria a flusso. Sono necessari tre set di provette (vedi Tabella 2): (1) provette contenenti i campioni; (2) provette con cellule BAL per ogni anticorpo-fluoroforo per realizzare singole colorazioni; Ciò consente di determinare le tensioni per ciascun canale sul citometro a flusso; e (3) tubi con perline per ogni anticorpo-fluoroforo per fare singole macchie; Questo serve a determinare la matrice di compensazione.
- Preparare una miscela di anticorpi e blocco Fc (anti-CD16/CD32) in PBS alle diluizioni appropriate (vedere Tabella 2). È necessario determinare la diluizione di lavoro ottimale per ciascun anticorpo prima dell'esperimento.
- Risospendere le cellule in 50 μl della miscela di anticorpi per il campione e aggiungere 50 μl dell'anticorpo opportunamente diluito ai controlli critici.
nota: La colorazione può essere eseguita in una piastra a forma di U a 96 pozzetti. Ciò consente di ridurre facilmente il volume della macchia e di prelevare quantità significative di campioni.
- Incubare per 30 minuti al buio a 4 °C.
- Centrifugare per 7 minuti a 400 x g e 4 °C. Eliminare il surnatante.
- Risospendere le cellule in PBS fino a un volume finale di 200 μL.
nota: Questo volume finale dipende dal volume minimo a cui il citometro a flusso può accedere. Questo può differire leggermente tra le macchine. Inoltre, il volume di lettura dipende dal numero di cellule e/o dal tempo necessario al campione per essere inserito nel citometro a flusso.
- Utilizzare i campioni e i controlli per l'analisi citofluorimetrica.
nota: Per determinare il numero assoluto di cellule delle diverse popolazioni cellulari, è necessario aggiungere le perle di conteggio. Aggiungere lo stesso numero di perline (± 25.000 perline) a ciascun campione appena prima della misurazione. Utilizzando la dispersione diretta e laterale, le microsfere di conteggio possono essere identificate mediante citometria a flusso (vedere la Figura 1). Successivamente, il numero assoluto di cellule nel campione può essere calcolato confrontando il rapporto tra gli eventi delle perle e gli eventi cellulari. Si può utilizzare la seguente formula:
- Analisi citofluorimetrica
nota: L'analisi citofluorimetrica deve essere eseguita immediatamente dopo il completamento del protocollo di colorazione. Deve essere utilizzato un citometro a flusso con laser e filtri appropriati per il rilevamento del segnale. La Tabella 3 fornisce una panoramica dei laser e dei filtri necessari per lo studio descritto in questo manoscritto. Per ulteriori informazioni sull'analisi citofluorimetrica, vedere Adan et al..
- Impostare i cancelli primari in base alla dispersione anteriore e laterale, escludendo detriti e doppietti (vedi Figura 1).
- Regolare la tensione e la compensazione della sovrapposizione spettrale con l'aiuto delle celle e delle perline colorate singolarmente.
nota: Queste impostazioni sono diverse per ogni citometro a flusso e devono essere controllate prima di ogni esperimento. Per una corretta analisi del flusso, le tensioni di dispersione diretta e laterale sono fondamentali. Una corretta dispersione in avanti e lateralmente può aiutare nell'identificazione e nella conferma dell'identità delle cellule analizzate. Per determinare queste tensioni, è necessario prima eseguire un campione non colorato.
- Impostare le porte di fluorescenza per l'antigene di superficie (vedere la Figura 1) e analizzare i campioni.
Tabella 1: Selezione degli antigeni di superficie delle cellule immunitarie. Questa tabella fornisce un elenco di epitopi di superficie utilizzati per caratterizzare i diversi tipi di cellule. Saranno necessarie combinazioni di diversi marcatori per definire in modo affidabile un tipo di cellula specifico.
| antigene | Tipo di cella |
| Cluster di differenziazione 3 (CD3) | Espresso sulle cellule T |
| Cluster di differenziazione 11c (CD11c) | Alta espressione sulla maggior parte delle cellule dendritiche, ma anche su monociti, macrofagi, neutrofili e alcune cellule B. |
| Cluster di differenziazione 11b (CD11b) | Espresso sulla superficie di molti leucociti, tra cui monociti, neutrofili, cellule natural killer, granulociti e macrofagi. |
| SiglecF | Macrofagi alveolari ed eosinofili. |
| MHCII | Normalmente si trova solo su cellule presentanti l'antigene come le cellule dendritiche, i fagociti mononucleati e le cellule B. |
| CD19 | Antigene dei linfociti B |
| Ly-6G | Un marcatore per monociti, granulociti e neutrofili |
Tabella 2. Elenco dei controlli da includere. Questa tabella mostra tutti i controlli necessari per l'interpretazione accurata dei risultati ottenuti.
| Campioni | | | | |
| tubo | Antigene-fluoroforo da aggiungere alle cellule | Concentrazione di anticorpi (mg/mL) | Diluizione degli anticorpi | Volume totale (μL) |
| Colorante di vitalità fissabile | 0,2 | 1/1000 | 50 |
| CD11c | 0,2 | 1/800 | 50 |
| SiglecF | 0,2 | 1/100 | 50 |
| campione X | MHCII | 0,2 | 1/200 | 50 |
| CD3 | 0,2 | 1/200 | 50 |
| CD19 | 0,2 | 1/200 | 50 |
| CD11b | 0,2 | 1/200 | 50 |
| Ly6G | 0,2 | 1/200 | 50 |
| Controlli di tensione | | | | |
| tubo | Antigene-fluoroforo da aggiungere alle cellule | Concentrazione di anticorpi (mg/mL) | Diluizione degli anticorpi | Volume totale (μL) |
| Celle non colorate | / | / | / | 50 |
| Celle a colorazione singola | Colorante di vitalità fissabile | 0,2 | 1/1000 | 50 |
| Celle a colorazione singola | CD11c | 0,2 | 1/800 | 50 |
| Celle a colorazione singola | SiglecF | 0,2 | 1/100 | 50 |
| Celle a colorazione singola | MHCII | 0,2 | 1/200 | 50 |
| Celle a colorazione singola | CD3 | 0,2 | 1/200 | 50 |
| Celle a colorazione singola | CD19 | 0,2 | 1/200 | 50 |
| Celle a colorazione singola | CD11b | 0,2 | 1/200 | 50 |
| Celle a colorazione singola | Ly6G | 0,2 | 1/200 | 50 |
| Controlli di compensazione | | | | |
| tubo | Antigene-fluoroforo da aggiungere alle perle | Concentrazione di anticorpi (mg/mL) | Diluizione degli anticorpi | Volume totale (μL) |
| Perline non macchiate | / | / | / | 200 |
| Perline a macchia singola | CD11c | 0,2 | 1/2000 | 200 |
| Perline a macchia singola | SiglecF | 0,2 | 1/2000 | 200 |
| Perline a macchia singola | MHCII | 0,2 | 1/200 | 200 |
| Perline a macchia singola | CD3 | 0,2 | 1/2000 | 200 |
| Perline a macchia singola | CD19 | 0,2 | 1/2000 | 200 |
| Perline a macchia singola | CD11b | 0,2 | 1/400 | 200 |
| Perline a macchia singola | Ly6G | 0,2 | 1/200 | 200 |
Tabella 3: Panoramica dei laser e dei filtri del citometro a flusso utilizzati in questo studio.
| Tipo di laser | Configurazione del filtro | |
| 505 LP | Codice: 525/50 |
| Blu (488 nm) | 550 LP | Codice: 575/26 |
| 100 mW | 670 LP | Codice: 685/35 |
| 750 LP | 780/60 |
| viola 405 nm | | 450/50 |
| 100 mW | | |
| rosso 633 nm | | 660/20 |
| 70 mW | 750 LP | 780/60 |
