1. Impostazione dei saggi MIC90 replicanti e non replicanti
- Inoculare M. tuberculosis, M. bovis BCG o M. smegmatis a un OD580 di 0,01-0,1 ed espandere alla fase logaritmica media (OD580 ~ 0,5) in Middlebrook 7H9-ADN (Middlebrook 7H9 contenente 0,2% di glicerolo, 0,2% di destrosio, 0,5% di albumina e 0,085% di NaCl) o 7H9-OADC (Middlebrook 7H9 contenente lo 0,2% di glicerolo e il 10% di integratore di OODIC).
- Coltivare M. tuberculosis e M. bovis BCG come colture in piedi da ~20 ml in fiasche di coltura cellulare e M. smegmatis con agitazione in polipropilene a fondo tondo (4 ml di coltura) o provette da centrifuga coniche da 50 ml (10-20 ml di coltura). Incubare i micobatteri patogeni a 37 °C con il 20% di O2 e il 5% di CO2 e il M. smegmatis a 37 °C con il 20% di O2.
- Impostare un esperimento in stile MIC90 (Minimal-inhibitory Concentration) in condizioni replicanti e non replicanti (Figura 1).
nota: Gli agenti di test vengono solitamente analizzati in duplicati o quadruplicati per consentire l'analisi di 4 o 2 composti, rispettivamente, per micropiastra a 96 pozzetti. Ad esempio, in una piastra a 96 pozzetti, un agente di prova può essere analizzato nelle righe A-D e un altro nelle righe E-H. Il DMSO (veicolo) si trova nelle colonne 1, 2 e 12 e la serie di diluizione dell'agente in esame va dalla colonna 3 (concentrazione minima) alla colonna 11 (concentrazione massima). I saggi in stile MIC90 impiegano tipicamente una serie di diluizioni a 2 volte. Esistono numerosi modelli non replicanti disponibili per i micobatteri e, a scopo illustrativo, stiamo utilizzando un modello multi-stress di non replicazione.
- Per il saggio replicante, distribuire 200 μl di cellule in 7H9-ADN a un OD580 di 0,01 in tutti i pozzetti di una piastra a 96 pozzetti trattata con coltura tissutale a fondo chiaro.
- Per il test non replicante, lavare due volte le cellule in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente lo 0,02% di tiloxapol e risospendere le cellule in terreno non replicante (0,05% KH2PO4, 0,05% MgSO4, 0,005% citrato ferrico ammonico, 0,0001% ZnCl2, 0,1% NH4Cl, 0,5% BSA, 0,085% NaCl, 0,02% tyloxapol, 0,05% butirrato; pH aggiustato a 5,0 con 2 N NaOH).
- Diluire le cellule a un diametro esterno di580 di 0,1 in un mezzo non replicante e aggiungere NaNO2 da un impasto da 1 M appena preparato a una concentrazione finale di 0,5 mM.
- Distribuire 200 μl di cellule con OD580 di 0,1 in tutti i pozzetti di una piastra a 96 pozzetti trattata con coltura tissutale a fondo chiaro.
nota: Preparare le diluizioni dei composti come soluzioni stock 100 volte in DMSO. Pertanto, una tipica piastra MIC che verifica l'impatto di una molecola a una concentrazione finale di 0,4-100 μg/ml richiederebbe soluzioni madre di 0,04-10 mg/ml in DMSO.
- Aggiungere 2 μl di diluizioni dell'agente in esame 1 nelle righe A-E e 2 μl di diluizioni dell'agente in esame 2 nelle righe E-H. Mescolare accuratamente.
- Aggiungere 2 μl di controllo del veicolo (solitamente DMSO) nei pozzetti di controllo, colonne 1, 2, 12 (righe A-H). Mescolare accuratamente.
- Per ogni esperimento, includere almeno un controllo positivo come la rifampicina da 0,004 a 1 μg/ml (saggio replicante) e/o da 0,08 a 20 μg/ml (saggio non replicante).
nota: L'uso di 6-bromo-1H-indazol-3-ammina9 da 0,1 a 25 μg/ml è raccomandato come composto di controllo che ha un'attività selettiva NaNO2-dipendente nel modello multi-stress di non replicazione.
- Per i saggi replicanti, incubare le micropiastre a 37 °C al 20% di O2 e al 5% di CO2 per 7 giorni (M. tuberculosis e M. bovis BCG) o 1-48 ore (M. smegmatis). Per il modello multi-stress di non replicazione, incubare micropiastre per 7 giorni a 37 °C all'1% di O2 e al 5% di CO2 (M. tuberculosis e M. bovis BCG).
2. Inoculazione di micropiastre CARA
- Nei momenti in cui il CARA verrà utilizzato come lettura, risospendere con cura il contenuto del pozzetto della piastra di saggio in stile MIC90 utilizzando una pipetta multicanale p200 impostata a 50-75 μl. Pipettare su e giù almeno 5-10 volte e agitare delicatamente il contenuto del pozzetto con un movimento circolare utilizzando i puntali della pipetta.
- Trasferire 10 μl di contenuto del pozzetto del saggio nella micropiastra CARA. Assicurarsi che l'ordine del contenuto del pozzetto sulla piastra di analisi corrisponda all'ordine del contenuto del pozzetto della micropiastra CARA. Evitare schizzi durante i trasferimenti e assicurarsi che i 10 μl siano posizionati al centro dei pozzetti della micropiastra CARA. Verificare che i 10 μl vengano assorbiti nella micropiastra CARA.
nota: Non sono necessarie diluizioni prima di individuare le cellule sulle micropiastre CARA.
- Lega le pile di micropiastre CARA con del nastro adesivo e poi mettile in un sacchetto di plastica richiudibile. Incubare le micropiastre CARA a 37 °C con il 20% di O2 (M. smegmatis) o l'1% di O2 e il 5% di CO2 (M. tuberculosis e M. bovis BCG).
- Per M. tuberculosis e M. bovis BCG, saggi replicanti: incubare per 7 giorni; per M. tuberculosis e M. bovis BCG saggi non replicanti, incubare per 10 giorni; per M. smegmatis, saggi replicanti, incubare per 1-2 giorni; per M. smegmatis, saggi non replicanti, incubare 2-3 giorni.
NOTA: I tempi sono stime e possono essere modificati di conseguenza per diverse condizioni di replica, non replicazione e stress.
3. Sviluppo di micropiastre CARA
- Sviluppare le micropiastre CARA quando un film di crescita batterica, o colonie macroscopiche più grandi, sono visibili sui pozzetti di controllo negativi (veicolo).
nota: Dopo un'incubazione prolungata, i pozzetti delle micropiastre CARA appaiono spesso asciutti e si consiglia di pre-bagnare il contenuto del pozzetto con PBS sterile. Questo serve a impedire al carbone di assorbire la resazurina, che può portare a una bassa fluorescenza o a una variazione da pozzo a pozzetto.
- Utilizzando un singolo set di 12 puntali p200 con una pipetta multicanale, erogare 40 μl di PBS sterile lungo il lato dei pozzetti e lasciare che il PBS si distribuisca sulla parte superiore delle microcolonie di agar/batteri.
- Preparare il reagente di sviluppo CARA mescolando 5 mg di resazurina (0,01% finale) e 50 ml di Tween-80 al 5% in PBS. Vortice e filtro sterile.
nota: Un reagente alternativo per lo sviluppo di CARA può essere preparato mescolando una soluzione liquida di resazurina preparata in commercio a 1:1 (vol/vol) con il 10% di Tween80 in PBS.
- Aggiungere 50 μl di reagente di sviluppo CARA appena preparato a ciascun pozzetto della micropiastra CARA utilizzando una pipetta a 12 canali. Le piastre di roccia avanti e indietro un paio di volte per aiutare a distribuire i reagenti sull'agar e sul tappetino batterico in ogni pozzetto.
- Porre le piastre in un sacchetto di plastica richiudibile e incubare a 37 °C per almeno 30 minuti per M. smegmatis e 45-60 minuti per M. tuberculosis o M. bovis BCG.
nota: Se i pozzetti di controllo del veicolo non diventano rosa entro la prima ora, le piastre possono essere nuovamente imbustate e incubate per periodi di tempo più lunghi.
- Prima di leggere la fluorescenza, posizionare le micropiastre CARA in una cappa di biosicurezza per 15 minuti a temperatura ambiente con i coperchi rimossi. Quando si utilizzano gli spettrofotometri BSL3 al di fuori di una cappa di biosicurezza, far aderire un adesivo PCR di qualità ottica sulla piastra e sigillare ermeticamente premendo delicatamente sulla superficie dell'adesivo con un tovagliolo di carta morbido.
- Determinare la fluorescenza tramite lettura dall'alto con eccitazione a 530 nm ed emissione a 590 nm. Non è necessario cancellare la piastra.
