1. Preparazione dei terreni e dei reagenti
- Preparare il terreno di coltura per fibroblasti. Combinare 450 ml di terreno Eagle modificato di Dulbecco (DMEM), 50 ml di siero fetale bovino (FBS) e 5 ml di penicillina/streptomicina. Conservare a 4 °C per un massimo di 3 mesi.
- Preparare il terreno di coltura dei macrofagi reporter in aliquote da 50 mL. Combinare 45 mL di DMEM, 5 mL di FBS, 5 μg/mL di reagente per l'eliminazione del micoplasma (Tabella dei materiali) e 200 μg/mL di fleomicina D1 (Tabella dei materiali). Conservare a 4 °C per un massimo di 3 mesi.
- Preparare il terreno di coltura per il saggio dei macrofagi reporter in aliquote da 50 mL. Combinare 45 mL di DMEM, 5 mL di FBS INATTIVATO A CALDO (HI-FBS), 5 μg/mL di reagente per l'eliminazione del micoplasma e 200 μg/mL di fleomicina D1. Conservare a 4 °C per un massimo di 3 mesi.
2. Rivestimento delle superfici di coltura cellulare con poli(metacrilato di metile)
- Sciogliere il poli(metilmetacrilato) (PMMA) in cloroformio a 20 mg/mL (ad es. 100 mg di PMMA in 5 mL di cloroformio) in una fiala di vetro scintillante da 20 mL. Posizionare un'ancoretta magnetica nella fiala e lasciare agitare per almeno 2 ore, fino a quando tutti i solidi non si saranno sciolti.
cautela: Il cloroformio è dannoso se inalato. Assicurarsi di utilizzare il solvente in una cappa aspirante mentre si indossano guanti in PVA.
- Pipettare 400 μL di soluzione di PMMA al centro di un vetrino da microscopio in vetro borosilicato in uno spin coater e centrifugare a 3000 giri/min per 2 minuti. Preparare il numero di vetrini necessari per il saggio, oltre a 3-5 in più per la misurazione dell'angolo di contatto con l'acqua. Conservare i vetrini in una scatola pulita (spruzzata e strofinata con etanolo al 70%) per un uso futuro.
nota: La centrifuga viene spesso utilizzata per depositare un rivestimento sottile e uniforme su una superficie piana. Una centrifuga ruota un substrato ad alta velocità, utilizzando la forza centrifuga per distribuire la soluzione di rivestimento sulla superficie.
- Misurare l'angolo di contatto con l'acqua in due posizioni casuali sulla superficie dei vetrini extra rivestiti (cioè, non i vetrini utilizzati per la coltura cellulare) con un goniometro per assicurarsi che la superficie del vetro sia stata completamente rivestita con il polimero.
NOTA: Per le misurazioni dell'angolo di contatto con l'acqua deve essere utilizzata solo acqua della massima purezza (ad es. vetro tripla distillazione).
- In una cabina di sicurezza biologica (BSC), collegare pozzetti appiccicosi a 8 camere a vetrini rivestiti in PMMA utilizzando una pinza sterile e seguendo la tecnica asettica. Premere con decisione sulla parte superiore dei pozzetti appiccicosi per assicurarsi che siano ben attaccati. Incubare i vetrini con pozzetti appiccicosi attaccati a 37 °C per una notte per garantire la tenuta.
- Testare la tenuta dei pozzetti appiccicosi aggiungendo 200 μL di acqua di coltura cellulare (priva di endotossine) a ciascun pozzetto. Incubare a temperatura ambiente (RT) per 60 minuti e assicurarsi che non vi siano perdite prima di procedere. Aspirare l'acqua, facendo attenzione a non disturbare il rivestimento in PMMA.
- Eseguire lavaggi con acqua priva di endotossine aggiungendo 300 μl di acqua priva di endotossine a ciascun pozzetto e incubando per 1 ora (tre volte), 12 ore e 24 ore prima dell'uso per rimuovere il solvente residuo.
- Testare la concentrazione di endotossine dei vetrini da utilizzare per la coltura cellulare. Incubare 200 μl di acqua reagente priva di endotossine (Tabella dei materiali) in un pozzetto di ciascun vetrino per 1 ora. Misurare la concentrazione di endotossine nell'estratto utilizzando un test dell'endotossina cromogenica endpoint (Tabella dei materiali).
nota: Il seguente protocollo è specifico per il kit di dosaggio delle endotossine elencato nella Tabella dei materiali.
- Utilizzare solo acqua e materiali di consumo (ad es. puntali per pipette, provette per microcentrifuga e piastre a pozzetti) certificati apirogeni (cioè privi di endotossine) per questo lavoro. Inoltre, qualsiasi vetreria utilizzata nella preparazione delle superfici rivestite di polimero deve essere depirogenata utilizzando la sterilizzazione a calore secco (250 °C per 30 minuti) prima dell'uso. La misurazione dell'endotossina nella soluzione estratta, come descritto qui, può comportare una sottostima dell'endotossina sulla superficie del materiale. Di conseguenza, si raccomanda che, durante lo sviluppo di un protocollo di rivestimento polimerico, si esegua la reazione di dosaggio delle endotossine (ovvero i passaggi 2.6.4-2.6.6 per i campioni di prova [acqua reagente] o i controlli spike) direttamente all'interno dei pozzetti contenenti il campione rivestito per garantire che nessuna fonte di endotossina venga introdotta inavvertitamente nel sistema durante il processo di rivestimento.
- Portare tutti i campioni di prova (ad es. estratti) e i reagenti del test delle endotossine alla RT. Ricostituire il reagente cromogenico nel tampone del saggio e lo standard di endotossina nell'acqua del reagente, lasciare sciogliere per 5 minuti e agitare delicatamente prima dell'uso. Coprire tutte le bottiglie con pellicola di paraffina quando non vengono utilizzate.
- Creare una curva di diluizione standard di 5-8 punti dello standard di endotossina che va dal limite inferiore a quello superiore del saggio eseguendo una diluizione seriale dello standard di endotossina nell'acqua del reagente.
- Per controllare l'aumento o l'inibizione del dosaggio delle endotossine nei campioni di prova, preparare un controllo positivo (chiamato anche controllo spike o campione spiked) diluendo una quantità nota di endotossina in una soluzione di campione di prova non utilizzata.
nota: La concentrazione del controllo positivo deve essere la stessa di uno standard al centro della curva standard. Se la quantità recuperata del picco di endotossina (cioè la concentrazione del controllo positivo meno la concentrazione del campione di prova non addizionato) è compresa tra il 50−200% della concentrazione nominale del picco di endotossina, si può ritenere che la soluzione di estrazione non interferisca in modo significativo con il saggio.
- Aggiungere 50 μl di standard, campioni o controlli spike a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti in doppio o triplice copiato. Utilizzare l'acqua reagente come controllo negativo.
- Aggiungere 50 μl di reagente cromogenico a ogni pozzetto. Aggiungere rapidamente il reagente a tutti i pozzetti. Utilizzare un timer per registrare il tempo necessario per aggiungere il reagente a tutti i pozzetti. Coprire la piastra con un sigillo adesivo e incubare a 37 °C (il tempo di incubazione dipende dal lotto ed è indicato nel certificato di analisi incluso nel kit di reagenti cromogenici). In alternativa, controllare la piastra ogni 15 minuti durante l'incubazione fino a quando non si osserva un cambiamento di colore in tutti i pozzetti standard.
- Dopo l'incubazione, aggiungere 25 μL di acido acetico al 50% in ciascun pozzetto (concentrazione finale del 10% di acido acetico per pozzetto) per arrestare la reazione. Aggiungere acido acetico nello stesso ordine in cui è stato aggiunto il reagente cromogenico. Leggere l'assorbanza della piastra utilizzando un lettore di piastre a 405 nm. Aspirare il liquido e scartare la piastra.
nota: L'aggiunta di acido acetico dovrebbe richiedere lo stesso tempo necessario per l'aggiunta a ciascun pozzetto (± 30 s).
- Sterilizzare i vetrini a raggi ultravioletti (UV) per 30 minuti prima degli esperimenti di coltura cellulare.
3. Fare il Lisato da Cellule 3T3
- Coltiva cellule 3T3 in più fiasche T150 fino al 70% di confluenza. Per staccare le cellule, aspirare il terreno, lavare la superficie con 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e aspirare il PBS. Aggiungere 5 mL di enzima di dissociazione cellulare ricombinante privo di origine animale (Tabella dei materiali) e incubare a 37 °C per 3-5 minuti.
- Staccare le cellule inclinando delicatamente il pallone avanti e indietro. Aggiungere 5 ml di PBS per neutralizzare l'enzima ricombinante utilizzato per la dissociazione cellulare. Trasferire le cellule staccate dai matracci in una provetta da centrifuga e miscelare mediante pipettaggio. Eseguire una conta delle cellule vive utilizzando un emocitometro e il colorante per la vitalità cellulare.
nota: È stato selezionato un enzima di dissociazione cellulare che può essere neutralizzato attraverso la diluizione in PBS per evitare l'introduzione di proteine a base di siero nella preparazione del lisato. Se la tripsina viene utilizzata per dissociare le cellule, deve essere neutralizzata con una soluzione contenente siero e deve essere eseguito un ulteriore lavaggio PBS per ridurre la quantità di proteine sieriche trasportate nella preparazione del lisato.
- Centrifugare le cellule a 200 x g per 5 minuti. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule nel volume originale (cioè 10 ml x numero di fiasche) di PBS per lavare via i terreni rimanenti. Ripetere.
- Centrifugare nuovamente le cellule a 200 x g per 5 minuti e aspirare il surnatante. Aggiungere il volume di PBS necessario per raggiungere una concentrazione cellulare finale di 1 x 106 cellule/mL. Porre la soluzione cellulare in un congelatore a -80 °C fino a quando il campione non è completamente congelato (almeno 2 ore).
- Scongelare la soluzione cellulare in un bagno d'acqua a 37 °C. Una volta completamente scongelata, rimettere la soluzione nel congelatore a -80 °C fino a completo congelamento. Ripetere per un totale di 3 cicli di congelamento-scongelamento.
- Eseguire un dosaggio dell'acido microbicinchoninico (BCA) sul lisato cellulare a una varietà di diluizioni (ad esempio, 1/100, 1/200, 1/500, 1/1000) per determinare la concentrazione proteica. Diluire il lisato cellulare a una concentrazione proteica di 468,75 μg/mL, aliquota, e conservare a -80 °C per un uso futuro.
nota: La concentrazione finale di proteine in una piastra a 48 pozzetti è di 125 μg/cm2 (basata sulla superficie di un pozzetto, 0,75cm2).
- Eseguire un Western blot per valutare la presenza di DAMPs nel lisato (ad es. proteina da shock termico 60 [HSP60], high mobility group box 1 [HMGB1]) caricando 40-60 μg di proteina del lisato nel tampone di carico su un gel di poliacrilammide al 10% di spessore di 1,5 mm e seguire le procedure standard del Western blot.
4. Valutazione dell'effetto degli strati proteici adsorbiti e dei recettori toll-like sull'attività NF-κB dei macrofagi
NOTA: Per uno schema del flusso di lavoro sperimentale e del layout delle lastre, fare riferimento rispettivamente alla Figura 1A e alla Figura 2.
- Coltiva i macrofagi reporter in un pallone di dimensioni adeguate fino alla confluenza del 70%. Aspirare il fluido, lavare la superficie con PBS e aspirare PBS. Aggiungere l'enzima di dissociazione cellulare ricombinante e incubare a 37 °C per 8 minuti.
- Staccare le celle picchiettando con decisione i lati del pallone. Inattivare l'enzima di dissociazione cellulare ricombinante aggiungendo un volume uguale di terreno di coltura (contenente il 10% di FBS). Eseguire una conta delle cellule vive utilizzando un emocitometro e il colorante per la vitalità cellulare.
nota: La vitalità attesa per i macrofagi reporter dopo un'incubazione di 8 minuti nell'enzima di dissociazione cellulare è del 90%.
- Centrifugare le celle a 200 x g per 5 minuti. Aspirare il surnatante e risospendere nel volume originale di PBS per lavare le cellule. Centrifugare nuovamente e risospendere le cellule a 7,3 x 105 cellule/mL in terreno di prova (contenente FBS inattivato termicamente).
- Separare la sospensione cellulare in 3 diverse provette: inibitore del TLR4, anti-TLR2 e non trattata. Incubare le cellule con 1 μg/mL di inibitore di TLR4 per 60 minuti a RT o con 50 μg/mL di anti-TLR2 per 30 minuti a RT.
- Aggiungere 200 μl di lisato, il 10% di FBS, il 10% di plasma di topo commerciale (Tabella dei materiali) o una miscela di soluzioni proteiche a una piastra a 48 pozzetti (o equivalente) e lasciare che la proteina si adsorba a 37 °C per il periodo di tempo desiderato (ad esempio, 30 min, 60 min o 24 ore). Aspirare le soluzioni proteiche dai pozzetti, utilizzando una pipetta Pasteur fresca per ciascuna soluzione proteica, e lavare le superfici con 250 μL di PBS per 5 minuti. Aspirare il PBS. Ripetere per un totale di 3 lavaggi.
nota: Potrebbe essere necessario avviare questo passaggio all'inizio del protocollo, a seconda del tempo di adsorbimento desiderato. Regolare il protocollo di conseguenza.
- Dopo il periodo di incubazione con l'inibitore TLR4 o l'anti-TLR2, pipettare le cellule per risospendere. Aggiungere 200 μl di soluzione cellulare a ciascun pozzetto.
- Per la condizione di controllo TLR2-positivo, aggiungere Pam3CSK4 (Pam3Cys-Ser-(Lys)4) a una concentrazione finale di 150 ng/mL. Per la condizione di controllo positivo TLR4, aggiungere lipopolisaccaride (LPS) a una concentrazione finale di 1,5 μg/mL. Incubare le cellule a 37 °C per 20 ore.
- Campionare 20 μl di surnatante da ciascun pozzetto e placcare in duplicato in una piastra a 96 pozzetti. Includere tre pozzetti di terreno di coltura da 20 μL come controllo di fondo. Aggiungere 200 μl di reagente del saggio reporter SEAP a ciascun pozzetto. Coprire la piastra con una guarnizione adesiva e incubare per 2,5 ore a 37 °C.
nota: Il tempo di incubazione può variare a seconda delle condizioni sperimentali e deve essere ottimizzato per una forte differenza di assorbanza tra pozzetti di controllo positivi e negativi.
- Trasferire il resto del surnatante in una provetta da 1,5 mL (per pozzetto). Centrifugare a 1.000 x g per 10 minuti per pellettare eventuali detriti. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 ml e conservarlo a -80 °C. Analizzare il surnatante per la presenza di citochine proinfiammatorie (ad es. fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α), interleuchina 6) tramite test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA).
- Rimuovere la guarnizione della piastra adesiva. Leggere l'assorbanza della piastra utilizzando un lettore di piastre a 635 nm. Aspirare il liquido e gettare la piastra.
