1. Generazione di lentivirus codificante CAR
NOTA: Una volta completata la costruzione del plasmide delle cellule T del recettore dell'antigene chimerico specifico (CAR) (CD47 e altri), i CAR lentivirali vengono generati con la procedura standard, utilizzando 293 cellule FT, una miscela di imballaggio lentivirale e agenti di trasfezione (vedi la Tabella dei materiali) come descritto. Successivamente, utilizzare un kit di reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa quantitativa (RT-PCR) e un termociclatore (vedere la Tabella dei materiali) per determinare il titolo virale misurando la quantità di RNA lentivirale secondo il protocollo del produttore. È importante che tutte le procedure lentivirali siano eseguite seguendo rigorosamente i requisiti di sicurezza.
- Seminare 15 x 10celle da 6 HEK293FT nel terreno di Eagle's modificato di Dulbecco (DMEM) e incubare le cellule per una notte a 37 °C in una capsula da 150 mm all'interno di un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica (CO2).
- Preparare due provette da 15 mL con complesso di trasfezione. La prima provetta contiene DNA plasmidico vettore lentivirale (5 μg) e miscela di packaging lentivirale (22,5 μg) in 2,5 mL di soluzione di diluizione per trasfezione. La seconda provetta contiene 82,5 μL di reagente di trasfezione in 2,5 mL di soluzione di diluizione per trasfezione (vedere la Tabella dei materiali).
- Inserire il contenuto della provetta 1 nella provetta 2 e incubare la miscela a temperatura ambiente per 15 minuti.
- Trasferire il contenuto della provetta goccia a goccia nella capsula delle cellule HEK293FT e incubare il campione per una notte a 37 °C in un incubatore umidificato con anidride carbonica al 5% e CO2
.
- Il giorno successivo, sostituire il terreno esistente con 19 mL di terreno di coltura DMEM fresco e continuare a incubare le cellule per una notte all'interno dell'incubatore umidificato al 5% di CO2 a 37 °C.
- Trasferire il terreno dal piatto in una provetta da centrifuga da 50 mL. Conservare la provetta con il mezzo contenente il virus in frigorifero.
- Ripetere la procedura di cui sopra, aggiungendo DMEM fresco e raccogliendolo nuovamente dopo 1 giorno.
- Combinare due raccolte di terreni in un'unica provetta da centrifuga. Centrifugare la provetta a 2.000 x g per 30 minuti a 4 °C.
- Trasferire la maggior parte del surnatante contenente lentivirus in una provetta da centrifuga ultratrasparente. Lasciare un volume minimo, circa 1 mL di surnatante per evitare di disturbare il pellet che può contenere cellule e/o detriti.
- Ultracentrifugare il surnatante sopra chiarificato a 110.000 x g per 100 minuti a 4 °C.
- Rimuovere il surnatante con cautela e aggiungere delicatamente 100 μl di terreno DMEM al pellet virale sul fondo della provetta. Lasciare il tubo sul ghiaccio per 15 minuti. Mescolare delicatamente la soluzione e aliquotare la soluzione di lentivirus in provette sterili preraffreddate. Conservare queste provette per il virus in un congelatore a -80 °C.
- Utilizzare un kit RT-PCR quantitativo per determinare il titolo del lentivirus secondo il protocollo del produttore, che estrae e misura l'RNA lentivirale.
2. Generazione ed espansione delle cellule T CAR
- Attivare le cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC) precedentemente congelate (da circa 1 x 106 a 2 x 106 cellule) in 1 mL di terreno di cellule T CAR con un numero uguale di microsfere rivestite di CD3/CD28 (vedere la Tabella dei materiali) e incubare le cellule a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2 per 24 ore.
- Scongelare un'aliquota del brodo di lentivirus con ghiaccio.
- Aggiungere 1 μL di agente di miglioramento della trasduzione nel pozzetto con le cellule e mescolare.
- Aggiungere lentivirus alle cellule a una molteplicità di infezione (MOI) di 5:1 e mescolare delicatamente. Il giorno successivo, ripetere questo passaggio (24 ore dopo la prima trasduzione).
- Monitorare la crescita delle cellule T ogni 2-3 giorni. Aggiungere altro terreno di coltura CAR T fresco per mantenere le cellule a una densità compresa tra 1 x 106 e 2 x 106 cellule/mL.
- Congelare le cellule T CAR con un protocollo standard utilizzando una soluzione di congelamento (vedere la Tabella dei materiali).
- Scongelare le cellule T CAR utilizzando un metodo standard e precoltivarle nel terreno di coltura delle cellule T CAR per circa ~2-4 ore con interleuchina-2, IL-2 (300 unità/mL) prima di applicarle al saggio.
3. Rilevamento dell'espressione di CAR mediante citometria a flusso
- Trasferire 3 x 10,5 cellule T CAR e cellule T non trasdotte in due provette per microcentrifuga separate da 1,5 mL.
- Centrifugare le provette a 300 x g per 2 minuti e risospendere le cellule in 200 μL di tampone di selezione cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) contenente l'1% di siero umano.
- Versare 100 μL di soluzione cellulare in due provette FACS di polistirene da 5 mL e tenere le provette in ghiaccio per 5 minuti.
- Aggiungere 1 μl di F(ab')2 biotinilato di capra anti-topo a una provetta di ciascun tipo di cellula. Quindi, aggiungere 2 μL di ficoeritrina, un anticorpo anti-tag marcato con PE (vedere la Tabella dei materiali) all'altra provetta di ciascun tipo di cellula. Mescolate bene e incubateli con ghiaccio per 30 minuti.
- Lavare le cellule con 3 mL di tampone FACS in ciascuna provetta e centrifugare le provette a 300 x g per 5 minuti; scartare i surnatanti e agitare il vortice molto brevemente o agitare brevemente le provette per risospendere le cellule nel liquido residuo.
- Aggiungere 2 μL di cellule presentanti l'antigene (APC) anti-CD3 e 2 μL di soluzione di anticorpi 7-Aminoactinomicina D (7-AAD) (vedere la Tabella dei materiali) in ciascuna provetta. Nella provetta di cellule colorate con anti-F(ab')2 Ab, aggiungere 1 μL di streptavidina marcata con PE. Mescolare brevemente e incubare le provette con ghiaccio per altri 30 minuti.
- Utilizzare il tampone FACS per lavare nuovamente le celle come descritto al punto 3.5 e aggiungere altri 200 μl di tampone FACS a ciascuna provetta.
- Utilizzare la citometria a flusso per analizzare le cellule prima eseguendo il gating sulle cellule T in un grafico a dispersione diretta rispetto a quello laterale e quindi utilizzando le cellule vive (7-AAD-negativo) in un grafico CD3 rispetto a 7-AAD. Il passaggio finale consiste nell'analizzare l'anti-tag, l'anti-ScFv o l'anti-F(ab')2 rispetto al CD3.
4. Saggio di potenza della citolisi in tempo reale (RTCA)
NOTA: Eseguire il test RTCA secondo le condizioni consigliate dal produttore. In breve, prima piastrate le cellule bersaglio nei pozzetti della E-Plate, seguita dall'aggiunta di cellule T CAR il giorno successivo. L'attività di citolisi delle cellule CAR T contro le cellule bersaglio viene monitorata in tempo reale. Le cellule T e le cellule T mock-trasdotte (Mock CAR T cells) sono utilizzate come controlli delle cellule effettrici negative. Il seguente protocollo descrive un test di potenza della citolisi in tempo reale in vitro per linee cellulari tumorali aderenti.
- Aggiungere 100 μl di terreno di coltura cellulare target a ciascun pozzetto della piastra E xCELLigence, posizionare la piastra all'interno dello strumento xCELLigence ed eseguire una lettura di base. Quindi, trasferire l'E-Plate in una cappa di coltura tissutale per la semina cellulare.
- Utilizzare un protocollo standard per tripsinizzare le cellule tumorali bersaglio dal dispositivo di coltura. Quindi trasferire le cellule in una provetta da centrifuga da 15 mL e aggiungere un terreno di coltura fresco, fino a 15 mL. Pellettare le celle mediante centrifugazione per 5 minuti a 200 x g. Scartare il surnatante, aggiungere 5 mL di terreno fresco e utilizzare una pipetta sierologica per risospendere delicatamente il pellet cellulare. Conta la densità delle cellule vive utilizzando un emocitometro e un microscopio.
- Regolare la densità cellulare in modo appropriato, quindi aggiungere 100 L di sospensione cellulare a ciascun pozzetto della E-Plate. Il numero di cellule bersaglio è tipicamente di circa 10.000 cellule/pozzetto per le linee cellulari aderenti (BxPC3, Hela-CD19 e SKOV3), o 30.000 cellule/pozzetto per le cellule in sospensione come Raji (vedi sotto per i dettagli relativi al prerivestimento dei pozzetti con anticorpi al fine di legare le cellule tumorali liquide).
- Equilibrare la E-Plate a temperatura ambiente per 30 minuti per consentire alle celle di depositarsi uniformemente sul fondo del pozzetto (questo è fondamentale; non saltare questo passaggio).
- Posizionare la E-Plate nello strumento xCELLigence all'interno dell'incubatore per colture cellulari e iniziare a misurare l'impedenza, visualizzata come indice cellulare rispetto al tempo, automaticamente ogni 15 minuti.
- Il giorno successivo, preparare le cellule T CAR effettrici. Assicurati di preparare in anticipo i controlli appropriati (ad esempio, cellule T CAR simulate, cellule T di controllo non trasdotte e/o cellule T CAR non correlate) per assicurarti che tutte le cellule siano pronte contemporaneamente. Regolare le celle effettrici e le celle di controllo alla densità corretta e preparare diluizioni seriali per garantire che i rapporti E:T desiderati vengano raggiunti quando 100 μL di sospensione di celle effettrici vengono aggiunti a ciascun pozzetto nella fase 9.
- Metti in pausa l'acquisizione dei dati xCELLigence e porta la E-Plate dall'incubatore a una cappa per colture cellulari.
- Rimuovere 100 μl di terreno da ciascun pozzetto. La quantità di terreno residuo in ciascun pozzetto è ora di 100 μL.
- Aggiungere 100 μl di cellule CAR T effettrici diluite in serie o altre cellule di controllo (ad es. cellule T CAR finte) per ottenere i rapporti E:T desiderati.
- Equilibrare la E-Plate a temperatura ambiente per 30 minuti per consentire alle cellule effettrici di stabilizzarsi, quindi riposizionare la E-Plate nello strumento xCELLigence. Riprendi l'acquisizione dei dati.
- Se lo si desidera, in momenti chiave è possibile sospendere l'acquisizione dei dati xCELLigence e rimuovere la piastra per raccogliere piccoli campioni da analizzare mediante saggi ortogonali (ad esempio, misurando la produzione di citochine mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) o citometria a flusso).
- Nell'esperimento sulle cellule T CAR-GFR-GITR-CD3, misurare la resa di interferone-gamma (IFNγ) con un kit ELISA (seguire le istruzioni del produttore; vedere la Tabella dei materiali).
nota PER QUANTO RIGUARDA L'USO DEI TUMORI LIQUIDI: Per testare le cellule tumorali ematologiche non aderenti, prima di aggiungere le cellule, i pozzetti della E-Plate vengono prima rivestiti con un anticorpo specifico per un antigene che è espresso sulla superficie delle cellule tumorali. Per la linea cellulare Raji B, viene utilizzato un reagente di tethering a base di anti-CD40 (vedere il kit di test liquido per l'uccisione del tumore nella Tabella dei materiali). Di seguito è riportata la procedura per rivestire la piastra:
- Diluire il reagente di tethering (anti-CD40) con il tampone di tethering a una concentrazione di 4 μg/mL.
- Lavorando all'interno di una cappa per coltura tissutale, aggiungere 50 μl del reagente di tethering diluito a ciascun pozzetto della E-Plate. Lasciare l'E-Plate a temperatura ambiente o in un'incubatrice a 37 °C per 3 ore.
- Rimuovere il reagente di fissaggio e lavare la piastra E almeno 2 volte con un tampone di lavaggio. A questo punto, la E-Plate è pronta per la semina delle cellule bersaglio Raji (30.000 cellule/pozzetto).
- Continuare con il passaggio 4.1 (sopra) per eseguire il resto della procedura.
