Un metodo in vitro per determinare l'attività anti-apoptotica degli anticorpi contro il TNFα

Abstract

Fonte: Tierrablanca-Sánchez, L., et al. Determinazione della potenza relativa di un anticorpo monoclonale anti-TNF (mAb) neutralizzando il TNF utilizzando un metodo bioanalitico in vitro. J. Vis. Exp. (2017)

Questo video dimostra una tecnica per valutare l'efficacia degli anticorpi contro il fattore di necrosi tumorale-alfa (TNFα), una citochina infiammatoria, attraverso un approccio bioanalitico in vitro. Il TNFα, quando introdotto nelle cellule stressate, innesca l'apoptosi. Tuttavia, il legame con gli anticorpi confina il TNFα, evitando l'apoptosi. Il grado di apoptosi viene quantificato utilizzando un saggio di bioluminescenza.

Protocollo

1. Preparazione dei Media e Soluzioni

1. Preparare il terreno di coltura: RPMI-1640 con il 10% di siero fetale bovino (FBS), pH 7,4.
2. Preparare il terreno di coltura del saggio: RPMI-1640 senza rosso fenolo ma con FBS all'1%, pH 7,4.
3. Preparare la soluzione di lavaggio cellulare: soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS) di Dulbecco priva di Mg e Ca con EDTA allo 0,02%, pH 7,4.
4. Preparare la soluzione di distacco cellulare: tripsina 0,125% con acido etilendiamminotetraacetico 1 mM (EDTA).
   1. Scongelare 100 mL di una soluzione allo 0,25% di tripsina-EDTA e trasferirli in un matraccio sterile da 500 mL.
   2. Miscelare con 100 mL di soluzione per il lavaggio cellulare ed erogare 15 mL di aliquote in provette sterili da 15 mL. Conservare a una temperatura compresa tra -70 e -80 °C fino al momento dell'uso.
   3. Filtrare queste soluzioni attraverso una membrana da 0,22 μm e riscaldare fino a 37 °C per almeno 30 minuti prima dell'uso.
5. Preparare la soluzione madre di TNFα per induzione dell'apoptosi a 3,3 μg/mL.
   1. Sciogliere 20 μg di TNFα con 500 μL di acqua sterilizzata con filtro nel suo contenitore primario e mescolare fino alla completa dissoluzione.
   2. Trasferire in una provetta sterile da 15 mL e aggiungere 5,5 mL di soluzione DPBS priva di Mg e Ca a questa provetta. Mescolare delicatamente con un miscelatore a vortice.
   3. Aliquotare la soluzione in porzioni da 70 μl. Erogare ciascuna aliquota in microprovette da 0,5 mL e conservare a -80 °C.
6. Preparare la soluzione di induzione dell'apoptosi: soluzione di TNFα a 40 ng/mL.
   1. Scongelare un'aliquota della soluzione madre per induzione dell'apoptosi, incubandola in un bagno d'acqua a 25 °C per 10 minuti.
   2. Diluire la soluzione madre per induzione dell'apoptosi a 40 ng/mL aggiungendo 61 μL di soluzione TNFα da 3,3 μg/mL a 4,939 mL di terreno di coltura in una provetta sterile da 15 mL.
   3. Mescolare con un miscelatore a vortice per 10 secondi; questa soluzione deve essere preparata fresca prima dell'uso.
   4. Riscaldare la soluzione a 37 °C per almeno 30 minuti prima di utilizzarla nel saggio di neutralizzazione.
7. Preparare la soluzione di substrato: soluzione di caspasi 3/7 Glo.
   1. Scongelare la soluzione tampone caspasi (tampone caspasi 3/7 Glo) per 12 ore prima dell'uso.
   2. Lasciare riposare separatamente la soluzione tampone della caspasi e il substrato (substrato della caspasi 3/7 Glo) a 25 ± 5 °C per 30 minuti prima della miscelazione.
   3. Trasferire 10 mL della soluzione tampone caspasi nel flaconcino del substrato e mescolare per inversione.
   4. Conservare a 25 ± 5 °C, al riparo dalla luce fino all'uso.
      nota: La soluzione è stabile per 6 ore a temperatura ambiente.

2. Coltura e conteggio delle cellule

1. Lo scongelamento cellulare e la prima subcoltura.
   1. Estrarre un flaconcino con le cellule WEHI 164 da un congelatore a -80 °C e trasferirle in un bagno di ghiaccio.
   2. Pipettare su e giù con 1 mL di terreno di coltura preriscaldato fino a quando le cellule congelate non si scongelano completamente.
   3. Erogare 9 mL di terreno di coltura preriscaldato su una provetta sterile da 15 mL.
   4. Trasferire la sospensione cellulare nella provetta sterile da 15 mL e mescolare delicatamente cinque volte per inversione.
   5. Centrifugare la sospensione cellulare a 125 x g per 3 minuti. Scartare il surnatante e disaggregare il pellet cellulare.
   6. Aggiungere 5 mL di terreno di coltura alla provetta. Mescolare fino a quando le cellule non sono completamente risospese.
   7. Per la conta cellulare, trasferire 50 μl della sospensione cellulare in una microprovetta da 500 μl e miscelare con 50 μl di blu di tripano allo 0,4%. Contare le cellule e regolarle a 0,5 x 10⁶ cellule/mL. Vedere il passaggio 2.2 di seguito.
   8. Aggiungere 13 mL di terreno di coltura preriscaldato a un pallone da 75 mL di coltura cellulare.
   9. Erogare un volume di sospensione cellulare sufficiente dalla fase 2.1.6 per ottenere 0,5 x 10⁶ cellule/mL nel pallone di coltura cellulare e incubare a 37 °C e 5% di CO₂ durante la notte.
2. Conteggio delle cellule.
   1. Utilizzando la soluzione del passaggio 2.1.6, trasferire 0,05 mL in un emocitometro e determinare la densità cellulare al microscopio utilizzando l'esclusione del blu di tripano.
   2. Quantificare il numero totale di cellule e di cellule vitali.
   3. Regolare le sospensioni cellulari a 0,5 x 10⁶ cellule/mL.
      V_{culture medium}(mL) =
      _{Terreno di coltura} V (mL) = (5mL -_{sospensione cellulare} V)
      _{Terreno di coltura} V (mL) = Volume regolato della sospensione cellulare WEHI 164
      NVC = Numero di cellule WEHI 164 vitali/mL
      _{Terreno di coltura} V (mL) = Volume del terreno di coltura del saggio aggiunto alla sospensione cellulare per ottenere 0,5 x 10⁶ cellule/mL
      0,5 x 10⁶ = Densità della cellula target
3. Il distacco cellulare e la seconda e la terza sottocoltura.
   nota: Un sistema a vuoto può essere utilizzato per rimuovere le soluzioni dai palloni . Possono essere utilizzate pipette sterili monouso o in vetro. Se la pipetta ha un intasamento di cotone nella parte superiore, deve essere rimosso prima dell'uso.
   1. Rimuovere il terreno di coltura dal pallone a T per colture cellulari utilizzando una pipetta sterile da 1 ml e un sottovuoto.
   2. Erogare 5 mL di soluzione per il lavaggio cellulare nel pallone di coltura, mescolare delicatamente ed eliminare la soluzione. Ripetere questo passaggio due volte.
      nota: La rimozione completa del terreno di coltura è fondamentale per un efficiente distacco delle cellule.
   3. Aggiungere 15 mL di soluzione per il distacco delle cellule al pallone a T e lasciare riposare per 3 minuti in un incubatore a 37 °C e 5% di CO₂.
   4. Verificare al microscopio l'assenza di cellule attaccate nella parete interna del pallone. Rimuovere le cellule dal pallone di coltura utilizzando una pipetta sterile da 20 mL e dispensarle in una provetta sterile da 50 mL.
   5. Centrifugare la sospensione cellulare a 125 x g per 3 minuti. Scartare il surnatante e risospendere il pellet con altri 5 mL di terreno di coltura.
   6. Contare le cellule e aggiungere una quantità sufficiente di terreno di coltura per raggiungere la concentrazione cellulare desiderata secondo l'equazione 1.
   7. Aggiungere questa sospensione a un pallone da 72 cm² e incubare per una notte a 37 °C e 5% di CO₂.
   8. Subcoltura delle cellule almeno due volte prima di utilizzarle nel saggio di neutralizzazione. Ripetere i passaggi 2.3.1-2.3.8 per i due giorni successivi.
4. Sospensione cellulare di saggio.
   1. Seleziona una sottocultura WEHI 164 che abbia almeno tre passaggi. Vedere il passaggio 2.1.
   2. Staccare e contare le celle secondo i passaggi 2.2 e 2.3 di questo protocollo.
   3. Diluire la sospensione cellulare secondo l'equazione 1 a 0,5 x 10⁶ cellule/mL.
   4. Utilizzare questa sospensione cellulare per il test di neutralizzazione. Mescolare tutte le sospensioni cellulari con un miscelatore a vortice prima dell'uso.

3. Preparazione e diluizione degli anticorpi

1. Quantificazione degli anticorpi monoclonali.
   1. Determinare la concentrazione della sostanza di riferimento, del campione di controllo e del campione da analizzare mediante assorbimento UV a 280 nm utilizzando il coefficiente di estinzione di massa (1,39).
      nota: Le concentrazioni originali potrebbero essere prese dalle etichette dei prodotti farmaceutici. Tuttavia, questo deve essere verificato mediante assorbimento UV.
2. Diluizioni di mAb.
   1. Diluire tutti i campioni in modo indipendente in triplicato, con soluzione DPBS priva di Mg e Ca in microprovette da 2 mL, fino a 2 mg/mL. Confermare questa concentrazione mediante assorbimento UV in triplicato, utilizzando come bianco una soluzione priva di DPBS senza Mg e Ca.
   2. Mescolare le soluzioni proteiche per 5 secondi utilizzando un miscelatore a vortice.
   3. Diluire 100 μl di ogni soluzione di mAb da 2 mg/mL con 0,9 mL del terreno di coltura del saggio.
   4. Mescolare per 5 s con un miscelatore a vortice.
      nota: Queste soluzioni hanno una concentrazione di 200 μg/mL. Le diluizioni devono essere effettuate per ogni triplicato.
   5. Diluire 10 μl di ogni soluzione di mAb da 200 μg/mL con 0,99 mL del terreno di coltura del saggio. Mescolare per 5 s utilizzando un miscelatore a vortice. Queste soluzioni hanno una concentrazione di 2 μg/mL. Eseguire diluizioni seriali per ogni triplicato prima di utilizzarle nel saggio di neutralizzazione.
   6. Effettuare diluizioni anti-anticorpi monoclonali TNFα in tre micropiastre indipendenti. Fare un duplicato da ogni triplicato indipendente e distribuirli in una micropiastra, come indicato nella Tabella 1. Sostanza di riferimento
   7. Eseguire diluizioni mAb di ciascun riferimento, campione o controllo, come mostrato nella Tabella 2.
      nota: Le concentrazioni di anticorpi monoclonali anti-TNFα descritte in questa tabella non sono le concentrazioni finali nel test di neutralizzazione.
   8. Conservare le piastre a 25 ± 5 °C fino al momento dell'uso.

4. Saggio di neutralizzazione con celle WEHI 164

1. Miscelare agitando tutte le sospensioni cellulari (0,5 x 10⁶ cellule/mL) prima della dispensazione in qualsiasi fase di questo protocollo.
   nota: In questa sezione, riscaldare ciascuna soluzione a 37 °C per 30 minuti prima dell'uso.
2. Trasferire 50 μl della sospensione cellulare in ciascuno dei 60 pozzetti delle micropiastre, passando dalla colonna 2 alla 11 e dalla linea B a G.
3. Trasferire 50 μl di diluizioni di riferimento, campione e controllo di mAb in micropiastre. Seguire lo schema illustrato nella Figura 1.
4. Aggiungere 50 μl della soluzione di induzione dell'apoptosi a ciascun pozzetto.
5. Utilizzare controlli cellulari di 50 μL di celle WEHI 164, dispensate in tre pozzetti. Portare ogni pozzetto a un volume finale di 150 μl con un terreno di coltura per il saggio.
6. Utilizzare un controllo di citotossicità di una miscela di 50 μl di cellule WEHI 164 più 50 μl di soluzione di induzione dell'apoptosi. Portare ogni pozzetto a un volume finale di 150 μl con un terreno di coltura per il saggio.
7. Per il controllo del TNFα, utilizzare 50 μl della soluzione di induzione dell'apoptosi e portarla a 150 μl con il terreno di coltura del saggio.
8. Per il bianco, utilizzare 150 μl del solo terreno di coltura del saggio.
9. Riempire i pozzetti rimanenti con 150 μl di terreno di coltura per evitare gli effetti dell'evaporazione della piastra.
10. Ripetere i passaggi 4.1.1-4.1.9 due volte in altre due micropiastre.
    nota: Le concentrazioni finali di mAb nella micropiastra sono: 0,666, 0,333, 0,167, 0,111, 0,083, 0,056, 0,042, 0,028, 0,014 e 0,004 μg/mL.
11. Caricare i campioni in micropiastre, come indicato nella Figura 1
12. Incubare le tre piastre a 37 °C e 5% di CO₂ per 16 ± 2 h.
13. Lasciare riposare il reagente caspasi 3/7 Glo a 25 ± 5 °C per 30 minuti prima dell'uso.
14. Aggiungere 100 μl di questo reagente a tutti i pozzetti, compresi i campioni e i controlli.
15. Agitare le piastre utilizzando un miscelatore a vortice per micropiastre per 3 minuti a 25 ± 5 °C subito dopo l'erogazione nei pozzetti.
16. Incubare le piastre per 2,5 ± 0,5 h a 25 ± 5 °C, al riparo dalla luce.
17. Inserisci le micropiastre nel luminometro e completa la sezione successiva.

5. Analisi dei risultati

1. Utilizzando il software per il rilevamento della luminescenza, selezionare la modalità di luminescenza e la funzione finale.
2. Selezionare una piastra a fondo trasparente a 96 pozzetti e i suoi 80 pozzetti interni, escluse le colonne 1 e 12.
3. Selezionare un tempo di integrazione di 1.250 ms e 10 s per la miscelazione della micropiastra prima della lettura.
4. Selezionare i pozzetti in cui verranno collocati la sostanza di riferimento, la sostanza analitica e il campione di controllo e identificarli con le concentrazioni corrispondenti.
5. Leggere i campioni inseriti nelle micropiastre con il luminometro.
6. Utilizzare una quarta equazione di parametro per l'analisi dei risultati. Rappresentare graficamente una curva dose-risposta, come illustrato nella Figura 2.
   NOTA: Nell'equazione del quarto parametro, C è la concentrazione efficace 50 (EC50). Questo valore sarà utilizzato per confrontare la sostanza di riferimento, il campione analitico e il campione di controllo mediante la funzione effettrice.
7. Per calcolare le potenze relative, fissare la sostanza di riferimento al 100%, calcolare le potenze del campione e controllare di conseguenza.
   nota: Questi valori sono illustrati nella Figura 3.

Tabella 1: Array di campioni di micropiastre. Un saggio di neutralizzazione completo deve essere eseguito in tre micropiastre entro le coordinate da B2 a G11. La distribuzione casuale di campioni di riferimento, analitici e di controllo consente ai ricercatori di verificare eventuali distorsioni nel test.

Piatto 1		Piatto 2		Piatto 3
Wells	campione	Wells	campione	Wells	campione
B2:B11	Sostanza di riferimento	B2:B11	Campione di controllo	B2:B11	Campione analitico
C2:C11		C2:C11		C2:C11
D2:D11	Campione analitico	D2:D11	Sostanza di riferimento	D2:D11	Campione di controllo
E2:E11		E2:E11		E2:E11
F2:F11	Campione di controllo	F2:F11	Campione analitico	F2:F11	Sostanza di riferimento
G2:G11		G2:G11		G2:G11

Tabella 2: Diluizioni anti-TNFα mAb. In questa tabella sono dimostrate le diluizioni seriali degli anticorpi monoclonali anti-TNFα. Le concentrazioni finali descritte in questa tabella non sono le concentrazioni del saggio, dove gli anticorpi monoclonali anti-TNFα sono stati diluiti di un fattore 3 (diluizione dell'anticorpo monoclonale + terreno di coltura + sospensione cellulare). Le righe in grassetto rappresentano le diluizioni provenienti dalle righe 3, 5, 7, 9 e 10; Le linee non in grassetto rappresentano la diluizione dalle righe 3, 4 e 6. Queste diluizioni seriali vengono eseguite appena prima di eseguire il saggio di neutralizzazione. È necessario prestare attenzione alla miscelazione pipettando su e giù tre volte prima di erogare le diluizioni.

Colonna a piastre	Volume del terreno di coltura del saggio (μL)	Volume della sostanza di riferimento, del campione analitico o del campione di controllo (uL)	Concentrazione nella piastra di analisi (ng/mL)
numero arabo	0	230	Anno 2000
3	150	150 dalla linea 2	1000
4	75	75 dalla linea 3	500
5	100	50 dalla linea 3	333
6	75	75 dalla linea 4	250
7	75	75 dalla riga 5	166
8	75	75 dalla linea 6	125
9	75	75 dalla linea 7	83
10	75	75 dalla linea 9	41
11	150	75 dalla linea 10	13

Risultati

Figura 1: Disposizione dei campioni nelle piastre di analisi. Le coordinate da B1 a G11 sono ben coordinate nelle micropiastre e descrivono le posizioni in cui vengono posizionate le diluizioni del campione. Le coordinate mancanti sono i pozzetti riempiti con i controlli e il terreno di coltura del saggio (A1-A12 e H1-H12). Questa distribuzione casuale dei campioni (diluizioni dirette e inverse nelle...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
WEHI 164	ATCC	CRL-1751	Cellule di fibrosarcoma da Mus musculus
RPMI-1640 Medio	ATCC	30-2001	Conservare il terreno a una temperatura compresa tra 2 °C e 8 °C
RPMI 1640 Medium, senza rosso fenolo	GIBCO	Codice 11835-030	Conservare il terreno a una temperatura compresa tra 2 °C e 8 °C
Tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenolo	GIBCO	Codice 25200-056	Conservare il terreno a una temperatura compresa tra -10 °C e -20 °C
DPBS, senza calcio, senza magnesio	GIBCO	Codice 14190-136	Conservare il terreno a una temperatura compresa tra 2 °C e 8 °C
Proteina ricombinante umana TNF-alfa	Sistemi di ricerca e sviluppo	210-TA-020	Conservare a una temperatura compresa tra -20 °C e -70 °C
Siero fetale bovino (USA), IgG super basse	HyClone	SH3089803	Conservare a una temperatura compresa tra -10 °C e -20 °C
Siero fetale bovino (USA), caratterizzato	HyClone	SH3007103	Conservare a una temperatura compresa tra -10 °C e -20 °C
Kit per il dosaggio della Caspasi-Glo 3/7	Promega	G8093	Conservare il substrato Caspase-Glo. 3/7 e il tampone Caspase-Glo. 3/7 a –20 ºC al riparo dalla luce
EDTA, sale disodico, diidrato, cristallo, reagente A.C.S.	J.T.Baker	8993-01	--
Campione di mAb Adalimumab	Probiomed	Na	Le concentrazioni finali nella micropiastra sono: 0,666, 0,333, 0,167, 0,111, 0,083, 0,056, 0,042, 0,028, 0,014 e 0,004 μg/mL
Riferimento e controllo mAb Adalimumab	Abbvie	Na	Le concentrazioni finali nella micropiastra sono: 0,666, 0,333, 0,167, 0,111, 0,083, 0,056, 0,042, 0,028, 0,014 e 0,004 μg/mL
Lettore di micropiastre	Dispositivi molecolari	Codice 89429-536	SpectraMax M3 multimodale
Software per la lettura di micropiastre	Dispositivi molecolari	--	SoftMax Pro 6.3 GxP
incubatrice	Revisione	Telefono 30482	Revco RNW3000TABB CO2 ad aria forzata
Cappa a flusso laminare	L'azienda Baker	200256	Panettiere SG603A-HE | Alta efficienza, classe II tipo A2