1. Produzione di MoDC ingenui
NOTA: I campioni di sangue intero sono stati ottenuti da un singolo vitello privo di agenti patogeni mediante puntura della vena giugulare con vacutainer eparinizzati (per questo studio sono state utilizzate otto provette di sangue da 9 ml). Trasporta il sangue in una ghiacciaia. Conservare i campioni a 2-4 °C per un uso successivo o elaborarli immediatamente. Mantenere il sangue in rotazione per evitare la coagulazione del sangue. Sterilizzare i vacutainer con etanolo al 70%. Tutti gli esperimenti successivi sono stati eseguiti con un campione biologico e sei repliche tecniche.
- Centrifugazione in gradiente di densità per isolare le PBMC dal sangue eparinizzato
- Mescola bene il sangue capovolgendolo 10 volte.
- Utilizzando una pipetta da 10 mL, trasferire 20 mL di sangue eparinizzato in una provetta sterile da 50 mL e diluirla con 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
- Pipettare 15 mL di terreno di isolamento linfocitario in una provetta sterile da 50 mL.
nota: Lasciare che il terreno di isolamento dei linfociti raggiunga la temperatura ambiente prima del pipettaggio.
- Inclinare la provetta da 50 mL contenente il terreno di isolamento dei linfociti in una posizione di 45°. Puntare la punta di una pipetta da 25 ml perpendicolarmente e sovrapporre con cura i 30 ml di sangue-PBS sopra il terreno di isolamento dei linfociti, senza mescolare i due. Molto lentamente, riportare la provetta da 50 ml in posizione verticale.
- Centrifugare a 800 × g per 35 min a 20 °C con la massima accelerazione e senza frenare (funzione di decelerazione disattivata).
- Utilizzare una pipetta Pasteur per raccogliere lo strato di PBMC (il sottile strato bianco subito dopo il primo strato di plasma) e trasferirlo in una nuova provetta da 50 mL.
nota: La centrifugazione in gradiente di densità separa il sangue intero in diversi strati. Di conseguenza, gli eritrociti si depositano sul fondo come un pellet, le cellule mononucleate (PBMC) si depositano sullo strato di interfaccia e il plasma forma lo strato superiore. I granulociti si trovano tra il pellet e lo strato di PBMC.
- Lavare le PBMC raccolte 2 volte aggiungendo PBS fino a un volume di 40 mL e miscelando accuratamente pipettando su e giù. Quindi, centrifugare a 500 × g a 4 °C per 7 min con la massima accelerazione e massima decelerazione.
- Scartare il surnatante per decantazione, risospendere il pellet in 15 mL di 1x tampone ammonio-cloruro-potassio (ACK) e incubare a temperatura ambiente per 10-15 min.
nota: Non incubare per più di 15 minuti. Il tampone ACK disponibile in commercio viene utilizzato per garantire la lisi dei globuli rossi residui (RBC) presenti nella frazione PBMC.
- Aggiungere PBS fino a un volume di 40 mL, quindi centrifugare a 500 × g e 4 °C per 7 minuti con la massima accelerazione e decelerazione.
- Eliminare il surnatante mediante travaso e ripetere il passaggio 1.1.9.
- Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 10 mL di terreno di coltura completo (a temperatura ambiente).
nota: Il terreno di coltura completo è composto da terreno di coltura cellulare RPMI 1640 integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina.
- Separazione magnetica delle cellule CD14+/− dalla popolazione di PBMC utilizzando biglie magnetiche coniugate con CD14
- Contare le cellule con un contacellule emocitometrico pulito utilizzando 10 μL di sospensione cellulare miscelata con 10 μL di soluzione di blu di tripano (0,4%).
NOTA: Il colorante blu di tripano è una sostanza chimica tossica e potenzialmente cancerogena. Deve essere maneggiato indossando dispositivi di protezione individuale (DPI) per evitare il contatto e i rifiuti devono essere gettati in un contenitore ermetico per rifiuti tossici specializzati. Le cellule morte appariranno blu, mentre le cellule vive appariranno chiare al microscopio.
- Centrifugare per 7 min a 500 × g.
- Scartare il surnatante utilizzando una pipetta e risospendere il pellet in un tampone di smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) utilizzando un volume di 40 μl per ogni 1 × 107 cellule. Miscelare accuratamente utilizzando una pipetta.
NOTA: Il tampone FACS è composto dal 2% di FBS e dal 2 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) disciolto in PBS.
- Aggiungere 5 μl di tampone a microsfere CD14 per 1 × 107 cellule e mescolare accuratamente utilizzando una pipetta.
- Incubare per 30 minuti a 4-8 °C per la selezione positiva dei monociti CD14+ bovini. Vortice ogni 15 minuti durante il periodo di incubazione.
- Passaggio facoltativo (per l'analisi della citometria a flusso): aggiungere 10 μl di anticorpo colorante CD14-FITC (isotiocianato di fluoresceina) con successiva incubazione per 15 minuti a 4-8 °C. Per ulteriori informazioni, fare riferimento all'analisi della citometria a flusso nella fase 5.
- Aggiungere 1 mL di tampone FACS e centrifugare per 7 minuti a 500 × g.
- Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 500 μl di tampone FACS per 1 × 108 cellule.
- Inserire la colonna di separazione delle cellule immunomagnetiche nel separatore (supporto della colonna magnetica) e posizionare una provetta di raccolta da 15 mL sotto l'uscita della colonna per raccogliere il flusso.
- Lavare la colonna con 1 mL di tampone FACS degassato. Dopo il risciacquo, sostituire la provetta da 15 ml usata con una nuova.
- Lasciare che la sospensione cellulare (dal passaggio 1.2.8) passi attraverso la colonna pipettando 1 × 108 cellule in 500 μl di tampone alla volta.
nota: Prestare attenzione a non generare bolle d'aria durante la miscelazione delle celle prima di farle passare attraverso la colonna.
- Sciacquare la colonna 3 volte con 3 mL di tampone FACS degassato ogni volta.
- Raccogli il flusso ed etichetta questa prima frazione eluita come frazione cellulare CD14− (PBMC meno monociti CD14+); questa è anche chiamata frazione linfocitaria naive.
nota: Le cellule CD14− vengono mantenute in un terreno di coltura completo fino alla produzione di MoDC pulsate con antigene.
- Rimuovere la colonna dal separatore.
- Posizionare una nuova provetta sterile da 15 mL sotto la colonna per la raccolta dell'effluente.
- Pipettare 5 mL di tampone FACS nella colonna e spingerlo immediatamente con uno stantuffo.
- Raccogli il flusso ed etichetta questa seconda frazione eluita come frazione cellulare CD14+; questa è anche chiamata frazione di monociti naïve.
- Aggiungere un terreno di coltura completo ai monociti CD14+ raccolti per ottenere 1 × 106 cellule/mL.
nota: Contare le cellule vive nella frazione cellulare CD14+ eluita per stimare il volume del terreno di coltura completo necessario per ottenere la conta cellulare desiderata.
- Prelevare una piastra sterile da 24 pozzetti e aggiungere 1 mL di sospensione cellulare (1 × 106 cellule/mL) a ciascun pozzetto.
- Differenziazione dei monociti naïve al CD14+ in MoDC naive mediante l'aggiunta del 3% p/v di cocktail di citochine (GM-CSF + IL-4) con un totale di 5 giorni di incubazione
- Integrare ogni pozzetto contenente monociti CD14+ con 40 μL (3% p/v) del cocktail di citochine fornito nel kit.
- Incubare la piastra in un'incubatrice umidificata con CO2 al 5% e a 37 °C per 48 ore.
- Il giorno 2, trasferire metà del contenuto di ciascun pozzetto (500 μL) utilizzando una pipetta in provette individuali da 1,5 mL e centrifugare a 500 × g a 4 °C per 7 minuti.
- Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 500 μl di terreno di coltura completo fresco.
- Trasferire 500 μl di questa sospensione cellulare dal passaggio 1.3.4 in ciascun pozzetto designato in modo che il volume finale sia di 1 mL.
- Arricchire ogni pozzetto con 20 μL di cocktail di citochine.
- Incubare la coltura per 72 ore in un'incubatrice umidificata con CO2 al 5% e a 37 °C.
- Dopo l'incubazione del giorno 5, rimuovere la piastra dall'incubatrice.
NOTA: Ogni pozzetto conterrà 1 mL di una sospensione cellulare di MoDC naive. Il numero di MoDC sarà una percentuale (~20%) dei monociti originali placcati (1 × 106/mL).
2. Generazione di MoDC pulsati con antigene
NOTA: Un vaccino disponibile in commercio e clinicamente approvato contro il virus della rabbia (RV) può indurre la differenziazione di MoDC naive in MoDC maturi che presentano l'antigene. Utilizzare lo 0,1% (~1 μL) di una singola dose di vaccinazione RV per generare MoDC pulsati con antigene. Inoltre, si preferisce produrre MoDC pulsate RV nella stessa piastra di coltura utilizzata per generare MoDC naive perché il trasferimento dei MoDC naive in una nuova piastra a 24 pozzetti li influenzerà negativamente.
- Aggiungere 1 μL/mL di sospensione RV a 1 mL di coltura MoDC naive nella piastra a 24 pozzetti e incubare per 48 ore al 5% di CO2 e 37 °C.
NOTA: le MoDC naive coltivate senza stimolazione RV vengono utilizzate come controllo di fondo (e come stimolazione non specifica per la co-coltura con i linfociti nelle fasi successive).
- Dopo l'incubazione, il giorno 7, tenere in ghiaccio la piastra a 24 pozzetti contenente i MoDC pulsati con antigene per 10 minuti.
- Aggiungere 1 mL di PBS ghiacciato per pozzetto. Miscelare accuratamente ogni pozzetto pipettandolo e trasferire la sospensione in una provetta da 15 mL.
- Lavare i pozzetti con 2 ml di PBS ghiacciato per raccogliere le cellule residue rimaste all'interno di ciascun pozzetto.
- Trasferire il contenuto nelle rispettive provette e centrifugare la sospensione cellulare a 500 × g per 7 minuti.
- Scartare il surnatante, risospendere il pellet cellulare (MoDC pulsati con antigene) in un terreno di coltura completo e regolare il volume fino a una concentrazione cellulare finale di 1 × 105 cellule/mL.
nota: Contare le cellule vive per stimare il volume di terreno necessario per ottenere la conta cellulare desiderata. Utilizzare MoDC pulsate RV dal giorno 7 per il sistema di co-coltura MoDC-linfociti.
3. Co-coltura MoDC-linfociti
NOTA: Il sistema di co-coltura MoDC-linfociti in vitro determina la capacità dei MoDC di innescare i linfociti antigene-specifici. I diversi gruppi di trattamento delle cellule dopo 16 giorni di co-coltura includono specifico, non specifico e di controllo. Il gruppo specifico è definito come linfociti co-coltivati con MoDC pulsate RV; il gruppo aspecifico è definito come linfociti co-coltivati con MoDC non pulsati con antigene; e il gruppo di controllo è definito come linfociti coltivati senza MoDC.
- Aggiungere un terreno di coltura completo alla frazione linfocitaria naïve eluita (cellule CD14) per ottenere una concentrazione cellulare di 2 × 106 cellule/mL.
NOTA: Contare le cellule vive nella coltura cellulare CD14− che sono state mantenute in un terreno di coltura completo in una piastra a 24 pozzetti dopo la loro raccolta per stimare il volume di terreno necessario per ottenere la conta cellulare desiderata.
- Il giorno 7, prelevare una piastra sterile da 24 pozzetti e seminare i pozzetti con 1 mL di sospensione di cellule linfocitarie naive (2 × 106 cellule/mL) più 1 mL di sospensione MoDC pulsata con antigene o non pulsata con antigene (1 × 105 cellule/mL).
nota: Il volume totale in ciascun pozzetto sarà di 2 mL con un rapporto di 1:20 MoDC per linfociti per pozzetto.
- Incubare la piastra per 48 ore a 37 °C e 5% di CO2.
- Arricchimento e restimolazione della coltura con MoDC pulsati con antigene
- Dopo l'incubazione della co-coltura MoDC-linfociti pulsata con antigene, il giorno 9, integrare ogni pozzetto con 20 ng/mL di IL-2 ricombinante e continuare a incubare per altre 120 ore (5 giorni di incubazione).
- Il giorno 14, trasferire 1 mL di co-coltura in una provetta sterile da 1,5 mL e centrifugare a 500 × g per 7 min.
- Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare con 1 mL di MoDC pulsati o non pulsati con antigene (1 × 105 cellule/mL). Miscelare delicatamente mediante pipettaggio e trasferire nuovamente le sospensioni cellulari nei pozzetti designati.
nota: A questo punto, il volume totale in ciascun pozzetto è di 2 mL.
- Continuare con l'incubazione al 5% di CO2 e 37 °C per 48 ore. Dopo l'incubazione del giorno 16, la co-coltura è pronta per l'analisi mediante citometria a flusso, qPCR ed ELISA.
nota: Per ogni 2 mL in ciascun pozzetto della co-coltura MoDC-linfociti, 1 mL di cellule risospese viene colorato per la citometria a flusso, 1 mL viene utilizzato per l'estrazione dell'RNA e i surnatanti di entrambi vengono utilizzati per ELISA.
4. Analisi citofluorimetrica
NOTA: Colorare le cellule con marcatori appropriati/mAb prima di eseguire i campioni su un citometro a flusso. Fare riferimento alla Tabella dei materiali per i dettagli sui reagenti (colorazione di mAb e controlli isotipici), kit, strumento e software utilizzati per l'analisi di citometria a flusso.
- Protocollo di colorazione del citometro a flusso
nota: Eseguire la colorazione della superficie cellulare per le PBMC e i linfociti e i monociti naive utilizzando anticorpi monoclonali anti-CD14 (passaggio 1.2.6). Per la colorazione della superficie cellulare dei MoDC naive, utilizzare mAb anticorpi monoclonali anti-CD86-specifici, anti-CD40-specifici e anti-MHC II-specifici. Per la colorazione della superficie cellulare delle cellule a partire dalle co-colture del giorno 16, utilizzare anticorpi monoclonali anti-CD4, anti-CD8 e anti-CD25; per la colorazione intracellulare, utilizzare anticorpi monoclonali anti-Ki-67. Inoltre, colorare le cellule con mAb di controllo isotipo negativo o senza mAb (FMO: fluorescente meno uno). La differenza principale nella colorazione per i marcatori di superficie e intracellulari è che per i marcatori di superficie cellulare, le cellule devono essere colorate con mAb di superficie specifico prima della colorazione viva/morta (L/D) o di qualsiasi altro processo. Tuttavia, la colorazione intracellulare viene eseguita dopo la colorazione L/D e richiede una fase di fissazione e permeabilizzazione per consentire la penetrazione intracellulare.
- Trasferire 1 mL di sospensione cellulare in una provetta sterile da 1,5 mL utilizzando una pipetta e centrifugare per 10 minuti a 500 × g.
NOTA: Dopo la centrifugazione, durante l'elaborazione delle cellule dalla co-coltura MoDC-linfociti, conservare il surnatante per l'analisi ELISA.
- Risospendere il pellet in 1 mL di PBS e trasferirlo in una provetta da 15 mL. Raccogliere le cellule residue utilizzando 1 mL di PBS e combinarle con il pellet risospeso.
- Aggiungere 10 mL di PBS alla provetta da 15 mL contenente le cellule, miscelare mediante pipettaggio e centrifugare per 7 minuti a 850 x g.
- Eliminare il surnatante e ripetere il passaggio 4.1.3.
- Scartare il surnatante e risospendere con cura il pellet di cella con la sospensione residua (circa 180 μl) rimasta dopo la decantazione del surnatante.
- Trasferire la sospensione cellulare in una piastra a 96 pozzetti con fondo a V e sigillare i pozzetti per evitare fuoriuscite.
- Centrifugare la piastra a 1.400 × g per 5 min. Dopo la centrifugazione, passare la piastra su un contenitore di scarto per svuotare i pozzetti del liquido e picchiettare la piastra su carta assorbente per garantire la rimozione del liquido in eccesso.
- Aggiungere 25 μl di miscela master per colorazione superficiale per pozzetto e mescolare delicatamente con una pipetta, seguita da incubazione a 4 °C per 30 min.
nota: Per preparare la miscela master per la colorazione superficiale per un singolo pozzetto, aggiungere 2,5 μl di mAb superficiale a 20 μl di tampone FACS.
- Aggiungere 200 μl di tampone FACS per pozzetto e centrifugare a 1.400 × g per 5 minuti. Dopo la centrifugazione, svuotare i pozzetti del liquido mediante travaso e picchiettare la piastra su carta assorbente per eliminare il liquido in eccesso.
- Aggiungere 100 μl di soluzione colorante L/D per pozzetto. Miscelare accuratamente con una pipetta, quindi incubare a 4 °C per 15 minuti al buio.
nota: Per un singolo pozzetto, sciogliere 0,25 μL di colorante L/D in 100 μL di tampone FACS. Il colorante L/D aiuta a distinguere tra cellule vive e morte.
- Aggiungere 100 μl di tampone FACS. Coprire i pozzetti con il coperchio e centrifugare la piastra per 1.400 × g per 5 minuti. Scartare il surnatante con la decantazione e picchiettare la piastra su carta assorbente.
- Ripetere il passaggio 4.1.11.
- Aggiungere 50 μl di soluzione di fissazione per pozzetto (fornito con il kit) e mescolare con una pipetta prima di incubare la piastra a temperatura ambiente al buio per 10 minuti.
- Aggiungere 150 μl del tampone di lavaggio per permeabilizzazione (PW) 1x fornito con il kit e coprire i pozzetti con il coperchio.
nota: Per preparare 10 mL di 1x tampone PW, diluire 1 mL di 10x tampone perm in 10 mL di dH2O.
- Centrifugare la piastra a 1.400 × g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante travasando e picchiettando la piastra su carta assorbente.
- Aggiungere 200 μl di 1x PW, quindi centrifugare a 1.400 × g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante mediante travaso e picchiettare la piastra su carta assorbente.
- Per la colorazione intracellulare, aggiungere 25 μL di miscela master per colorazione intracellulare (anti-Ki-67 mAb) per pozzetto. Mescolare bene e incubare la piastra per 30 minuti a 4 °C o con ghiaccio al buio.
nota: Per preparare la miscela master di colorazione intracellulare per un singolo pozzetto, aggiungere 1 μL di Ki-67 mAb a 24 μL di 1x PW. Il marcatore di colorazione intracellulare viene utilizzato solo durante l'elaborazione delle cellule dalla co-coltura del giorno 16. La colorazione intracellulare non viene eseguita durante l'elaborazione di PBMC, linfociti naïve, monociti e MoDC naive.
- Dopo l'incubazione, aggiungere 200 μL di 1x PW a ciascun pozzetto. Mescolare con una pipetta e centrifugare per 1.400 × g per 5 min. Scartare il surnatante con la decantazione e picchiettare la piastra su carta assorbente.
- Aggiungere 200 μl di tampone FACS, quindi centrifugare a 1.400 × g per 5 minuti. Scartare il surnatante mediante travaso e picchiettare la piastra su carta assorbente.
- Risospendere il pellet cellulare in 200 μL di tampone FACS e trasferire il contenuto di ciascun pozzetto in provette sterili separate per citometro a flusso. Utilizzare 300 μl di tampone FACS per pozzetto per raccogliere le celle residue. Le cellule sono ora pronte per l'analisi di citometria a flusso.
- Esecuzione del campione su un citometro a flusso
nota: I campioni sono stati analizzati su un citometro a flusso (utilizzando laser a 488 nm, 638 nm e 405 nm) secondo il manuale del produttore. Fare riferimento al manuale per i dettagli, la risoluzione dei problemi e la personalizzazione del protocollo.
- Eseguire le procedure di pulizia ordinaria prima e dopo la lettura dei campioni.
nota: Non saltare una posizione durante il caricamento dei tubi nello strumento.
- Per il ciclo di pulizia, utilizzare un totale di quattro provette, con la prima provetta contenente il reagente di pulizia del flusso e le restanti tre provette contenenti dH2O; ogni provetta avrà 3 mL. Durante la corsa di pulizia, acquisire dati con una portata media per circa 1 minuto catturando 100.000 eventi per tubo sotto i 330 V per la dispersione diretta (FSC) rispetto ai 265 V per la dispersione laterale (SSC).
nota: Durante la pulizia non devono essere segnalati detriti o eventi cellulari; In tal caso, eseguire nuovamente la fase di pulizia. Per eseguire i campioni, assicurarsi che tutti i campioni siano in una sospensione omogenea prima di acquisire i dati perché ciò garantisce una lettura accurata.
- Per collegare e accendere il citometro, fare clic sul pulsante dell'applicazione situato nell'angolo sinistro della barra del titolo. Dal menu a discesa dell'applicazione, selezionare l'opzione Citometria e fare clic sull'opzione Power On.
nota: Dal menu a discesa dell'applicazione, l'opzione Apri consente agli utenti di sfogliare i test preprogrammati, mentre l'opzione Nuovo protocollo consente agli utenti di creare nuovi protocolli.
- Caricare inizialmente il campione di controllo negativo nel supporto multitubo. Seleziona Nuovo protocollo e osserva l'elenco di lavoro sul lato sinistro dell'area di lavoro/schermo.
- Sulla lista di lavoro, definire la posizione del campione nel supporto multi-provetta e dare un nome al campione e al protocollo per l'identificazione.
- Dal pannello hardware situato sul lato sinistro dell'area di lavoro, regolare e selezionare più parametri come i rivelatori (FSC, SSC e 10 intervalli di fluorescenza), le tensioni (V) e i guadagni dei fotomoltiplicatori e l'area-altezza-larghezza (AHW) del segnale.
nota: Le seguenti impostazioni per i rivelatori sono state selezionate in base all'esperimento e allo strumento utilizzato: FSC-AHW: AHW, V: 270, G: 5; SSC-AHW: A, V: 350, G: 10; FL1 (CD8/FITC Destrano)-AHW: A, V: 400, G: 1; FL2 (CD25/PE)-AHW: A, V: 500, G: 1; FL6 (CD4/Alexa Fluor 647)-AHW: A, V: 700, G: 1; FL7 (Ki-67/Alexa Fluor 700)-AHW: A, V: 625, G: 1; FL9 (L/D)-AHW: A, V: 425, G: 1.
- Dal pannello di controllo dell'acquisizione dello strumento situato sotto la barra del titolo, regolare le opzioni per la portata (media), il tempo (5 min) e gli eventi (vedere il passaggio 5.2.8) che si desidera rilevare. Cliccare sull'opzione Acquisisci singolo per consentire allo strumento di prelevare/eseguire il campione e mostrare l'anteprima in tempo reale degli eventi rilevati.
- Dall'anteprima in tempo reale, regola la soglia di fluorescenza (tensione e guadagno) e le dimensioni delle celle per disegnare eventualmente i gate attorno alla popolazione cellulare desiderata escludendo eventuali detriti cellulari.
nota: L'FSC aiuta a distinguere le cellule in base alle dimensioni, consentendo così agli utenti di differenziare tra le cellule del sistema immunitario, come i monociti e i linfociti; i monociti sono più grandi e mostrano una maggiore intensità di FSC rispetto ai linfociti.
- Acquisisci un totale di circa 5.000 MoDC vivi, 50.000 linfociti vivi e 50.000 eventi di monociti vivi.
- Una volta regolati tutti i parametri in riferimento al campione di controllo negativo, fare clic su Stop e salvare il protocollo.
- Ora carica tutti i campioni sul caricatore multitubo. Definire ogni campione sulla lista di lavoro e applicare i parametri regolati in riferimento al controllo negativo a tutti i campioni all'interno dell'esperimento. Fare clic sull'opzione Acquisisci per consentire l'esecuzione consecutiva di tutti i campioni dell'esperimento.
- Una volta acquisiti i dati di tutti i campioni, salvarli e trasformarli in dati leggibili utilizzando un apposito software di analisi dei dati che consente la generazione di istogrammi sequenziali bi-parametrici e mono-parametrici.
