Un test di disturbo degli emociti per valutare la riadesione degli emociti alle tasche ematopoietiche

Abstract

Fonte: Petraki, S. et al., Saggi sulle popolazioni di cellule del sangue della larva di Drosophila melanogaster.J. Vis. Exp.(2015)

Questo video dimostra il test di disturbo dell'emocita, valutando la riadesione degli emociti nelle tasche ematopoietiche delle larve di Drosophila. Il disturbo meccanico rilascia gli emociti residenti, aumentando la conta degli emociti circolanti. Dopo il recupero, la riaderenza degli emociti residenti è confermata, illustrando la reversibilità.

Protocollo

1. Saggio di sanguinamento/raschiamento degli emociti

1. Preparazione delle diapositive:
   1. Opzione 1 per microscopi senza funzione di scansione delle piastrelle: per ogni larva da analizzare, preparare un vetrino con circa 5 pozzetti per Pap-pen di 2 mm quadrati ciascuno, corrispondenti all'area di visualizzazione del campo del microscopio; aggiungere circa 5 - 10 μl di terreno S2 a ciascuno (Figura 1A). Conservare i vetrini in una camera umida per evitare che i pozzetti si secchino.
   2. Opzione 2 per microscopi con funzione di scansione delle piastrelle: per ogni larva da analizzare, preparare un vetrino con 3 o 4 pozzetti per Pap-pen di ~3 - 4 mm quadrati ciascuno; aggiungere circa 15 - 20 μl di terreno S2 a ciascun pozzetto (Figura 1B). Conservare i vetrini in una camera umida per evitare che i pozzetti si secchino.
      nota: Il numero di pozzetti sopra raccomandato è sufficiente per un totale fino a 3.000 emociti per larva (larve tardive del 2^° stadio, ~2,5 - 3 mm di lunghezza, transgene che marcano la maggior parte delle cellule del sangue larvale). Quando si valuta un numero maggiore di cellule del sangue, potrebbero essere necessari più pozzetti per evitare il sovraffollamento.
2. Collezione di larve:
   1. Spruzza l'acqua in una fiala di mosca contenente larve e sciacqua le larve in una capsula di Petri, oppure raccogli del cibo che contiene larve in una capsula di Petri e diluiscilo con acqua usando una bottiglia a spruzzo.
   2. Raccogli delicatamente le larve dalla capsula di Petri usando un pennello e mettile in acqua in una capsula per cavità o su uno scivolo su un blocco freddo.
      nota: Le larve possono essere conservate per un tempo limitato in acqua o su un blocco freddo; Utilizzare campioni entro 45 minuti o meno per evitare la morte larvale o effetti indesiderati sugli emociti.
3. dissezione:
   1. Seleziona le larve al microscopio a fluorescenza su un blocco di metallo freddo. Misura le dimensioni e l'immagine delle larve, se lo desideri.
   2. Isolamento degli emociti circolanti ("sanguinamento"):
      1. Una volta selezionate le larve, posizionare una larva nel primo pozzetto della Pap-pen (Figura 1C, 2A).
      2. Usa 2 aghi puliti o forbici da dissezione e pinze per praticare un'incisione sia all'estremità posteriore che a quella anteriore della larva. Per evitare di disturbare gli emociti residenti, è meglio praticare queste incisioni sul lato ventrale della larva. Per risultati coerenti, praticare le incisioni nelle stesse posizioni per ogni larva. Per le larve di 1^° stadio, è sufficiente 1 incisione (nella parte anteriore ventrale).
      3. Lasciare che la larva sanguini per alcuni secondi senza alcuna pressione o agitazione fisica (Figura 2A).
         nota: Se si lavora su più larve, è meglio praticare queste incisioni per ciascuna di esse prima di procedere al passaggio successivo per evitare di tenere le larve sul ghiaccio troppo a lungo, il che potrebbe compromettere l'integrità dei campioni.
      4. Sollevare delicatamente la larva con gli aghi o le pinze e immergerla nel secondo pozzetto per sciacquare gli emociti circolanti rimasti. Successivamente, segui con il rilascio degli emociti residenti.
   3. Isolamento degli emociti residenti ("Scrape"):
      1. Trasferire delicatamente la larva nel pozzetto successivo (Figura 2C).
      2. Identificare la ghiandola linfatica della larva, che in genere si trova a circa 1/3 dall'estremità anteriore della larva e che può emettere fluorescenza dorsale attraverso la parete del corpo larvale. Evitare la ghiandola linfatica durante il rilascio degli emociti residenti bloccando la larva con un ago il più vicino possibile alla ghiandola linfatica per evitare la perforazione (Figura 2C).
         nota: Durante il normale sviluppo, la maturazione degli emociti delle ghiandole linfatiche è ritardata rispetto agli emociti larvali e i reporter fluorescenti degli emociti differenziati potrebbero non mostrare un segnale nelle ghiandole linfatiche delle giovani larve. In questi casi, è necessario prestare meno attenzione alla ghiandola linfatica poiché non è prevista alcuna contaminazione degli emociti larvali differenziati marcati in fluorescenza da parte degli emociti delle ghiandole linfatiche.
      3. Rilasciare le cellule del sangue residenti in un processo di dissezione di raschiamento e/o puntura. Usa una punta dell'ago per fissare efficacemente la larva vicino alla ghiandola linfatica (vedi sopra) o ad altre aree del corpo, se necessario. Utilizzare un altro ago per colpire i gruppi di emociti visibili attraverso la parete del corpo larvale (Figura 2C, E), con l'obiettivo di separare gli emociti. Gli emociti possono anche essere rilasciati con un movimento raschiante. Tuttavia, la lacerazione precoce dell'epidermide può rilasciare grandi gruppi di cellule del sangue, il che potrebbe rendere più difficile il conteggio automatizzato><. nota: A seconda dell'età e del genotipo della larva, il numero di emociti totali varierà. Distribuire il processo di rilascio sopra descritto su diversi pozzetti per evitare il sovraffollamento di alcuni pozzetti con cellule del sangue, che potrebbe rendere più difficile l'analisi delle immagini di singole cellule.
      4. Se nella carcassa finale rimangono pochi emociti, contare questi emociti mediante osservazione al microscopio e uso di un contatore manuale (Figura 2E). Per facilitare il conteggio, posizionare la carcassa su un'area pulita dello stesso vetrino e stenderla il più sottile possibile per ridurre il numero di piani ottici.
      5. Una volta completata la dissezione, attendere tra i 5 e i 10 minuti affinché le cellule si stabilizzino (ma non necessariamente aderiscano) prima di eseguire l'imaging dei pozzetti. Incubare il vetrino in una camera umida per evitare che si secchi ed evitare una manipolazione brusca dei vetrini, che potrebbe disturbare gli emociti sedimentati.
         nota: Quando si determina la conta degli emociti, le cellule rilasciate non vengono fissate e le cellule devono essere sottoposte a imaging poco dopo la dissezione, preferibilmente entro 30 minuti dal rilascio dalla larva. A seconda del volume del terreno e delle proprietà della cella, la stragrande maggioranza delle cellule si sarà stabilizzata entro 5-10 minuti, il che dovrebbe essere confermato dalla messa a fuoco attraverso i piani ottici del mezzo nel pozzetto. Tuttavia, a questo punto solo una frazione delle cellule del sangue avrà aderito alla superficie del vetrino, un fatto che deve essere considerato se si modifica questo protocollo per approcci basati sulla fissazione cellulare.
4. quantificazione:
   1. Scattare immagini degli emociti sedimentati al microscopio a fluorescenza (Figura 2B, D, F). Proseguire con la quantificazione degli emociti utilizzando il software ImageJ.
   2. Preparare l'immagine per l'algoritmo di conteggio delle cellule ImageJ:
      1. Aprire l'immagine del pozzo utilizzando ImageJ: File → Apri → (individuare il file e selezionare).
      2. Assicurati che le immagini siano a 8 o 16 bit. Regola la soglia per l'immagine selezionando Immagine, quindi fai clic su Regola e seleziona Soglia. Osservare la "Finestra di soglia" (Figura 3A).
      3. Seleziona l'opzione "Sfondo scuro". Selezionare "Rosso" e aumentare il livello di soglia inferiore (vedere la freccia nera) fino a quando ogni cella dell'immagine è contrassegnata da un punto rosso (le celle che non vengono coperte saranno visibili in scala di grigi; Figura 3B). Man mano che la Soglia Inferiore viene aumentata, alcune celle non saranno contrassegnate. Questo può essere l'indicatore di quanto lontano impostare la soglia inferiore.
         nota: Occasionalmente i gruppi di cellule non possono essere risolti e verrebbero contati come uno solo dal contatore di particelle. In questi casi, il numero di celle in un cluster può essere stimato esaminando l'immagine (ingrandendo se necessario) e contando manualmente utilizzando un contatore di conteggio. In alternativa, la Soglia Inferiore può essere aumentata per risolvere gruppi di celle; Tutte le cellule non marcate risultanti da questa manipolazione possono quindi essere contate utilizzando un contatore di conteggio.
   3. Analizza il numero di cella utilizzando ImageJ:
      1. Avviare l'analizzatore di particelle per contare le celle (Figura 3C). Selezionare Analizza e fare clic su Analizza particella. Opzionalmente selezionare "Sovrapponi contorni" per vedere le particelle che l'algoritmo conta (Figura 3D). In alternativa, imposta un limite alla dimensione o all'area dei pixel di un'unità (ad esempio, cella, gruppo di celle, ecc.) per il conteggio dell'algoritmo.
      2. Fare clic su OK. Osservare una finestra di riepilogo con il conteggio (Figura 3E).

2. Saggio del disturbo degli emociti

1. Per disturbare gli emociti, selezionare le larve e metterle in una provetta da microcentrifuga da 2 ml con circa 0,5 g di perle di vetro (212 - 600 μm) e aggiungere 0,5 ml di acqua.
2. Agitare il tubo, a mano, alla velocità 10 per 1 min.
3. Recupera le larve dalle perle di vetro versando il contenuto della provetta da microcentrifuga in una capsula di Petri e raccogliendo le larve con un pennello.
4. Per la fase di recupero, posizionare le larve in piastre di Petri precedentemente preparate con piccole quantità di cibo per mosche. Lasciare che le larve ristabiliscano il loro modello di emociti per un periodo di 45 minuti o come desiderato.
   nota: Scartare tutte le larve che hanno smesso di muoversi, poiché sono morte nel processo. Tuttavia, in genere vediamo pochi danni dopo 1 minuto di vortice.
5. Al termine del periodo di recupero, continuare con il test di sanguinamento/raschiamento come descritto sopra nella Sezione 1.

Risultati

Figura 1. Impostazione e schema del saggio di sanguinamento/raschiamento degli emociti e disturbo. (A)Impostazione del vetrino a immagine singola: cinque quadrati da 2 mm per l'imaging con un obiettivo 5X. (B) Impostazione del vetrino a scansione di piastrelle: quattro quadrati da 3 mm per l'imaging di sbavature/graffi di larve da ≤2,5 mm con un microscopio a scansione di piastrelle....

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastre di Petri da 6 cm/9 cm			Uno per ogni genotipo da valutare
Bottiglia d'acqua
Cucchiaio/spatola in metallo
Pennello sottile			ad esempio un "rivestimento"
Piatto per cavità in vetro
Penna PAP: Super PAP PEN IM3580	Beckman Coulter
Vetrini			Ogni diapositiva avrà 5 o più quadrati PAP PEN disegnati su di essi. La dimensione dei quadrati dipende dall'obiettivo di imaging e dall'ingrandimento della fotocamera del microscopio; ad es. quadrati da 2 mm.
Camera umida			Questo servirà per evitare che scivoli e pozzetti si secchino: contenitore sigillato con tovaglioli di carta bagnati che rivestono i lati/fondo
Terreni di coltura cellulare di Drosophila di Schneider	Invitrogen
Blocco freddo			Si tratta di un blocco di metallo (noto anche come blocco riscaldante) raffreddato in un secchio contenente ghiaccio; preferibilmente di colore nero o di altro colore scuro e non riflettente
Due siringhe da 1 ml con aghi (27 G 1/2)	Becton Dickinson		Per dissezioni.
Opzionale: forbici a molla chirurgica (tagliente 2 mm)	Strumenti per la scienza
Perle di vetro, 212-600 micron	sigma
Provette Eppendorf da 2 ml	Eppendorf		Uno per genotipo valutando
Miscelatore a vortice	Fisher Scientifico
Larve di Drosophila transgeniche con emociti marcati in fluorescenza. I transgeni adatti includono: HmlΔ-DsRed (Makhijani et al., 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi et al., 2009), BcF6-CFP e -GFP (Gajewski et al., 2007), o HmlΔ-GAL4 (Sinenko e Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer et al., 2005), He-GAL4 (Zettervall et al., 2004), Crq-GAL4 (di H. Agaisse (Stramer et al., 2005)), o eater-GAL4 (Tokusumi et al., 2009) combinati con UAS-GFP o altri transgeni di proteine fluorescenti.
Microscopio da dissezione a fluorescenza	Leica		Qui: Leica M205, opzionale con fotocamera, software di imaging e modulo di misurazione
Microscopio a fluorescenza invertito con attacco per fotocamera	Leica o Keyence		Con o senza funzione di scansione delle tessere (es. Leica serie DMI, Keyence BIOREVO serie BZ-9000)