Una tecnica di colorazione del tetramero peptide-MHC-I per analizzare le cellule T di memoria CD8+ specifiche per SIV

Abstract

Fonte: Gonzalez-Nieto, L., et al. Analisi delle cellule T CD8⁺ specifiche del virus dell'immunodeficienza delle scimmie nei macachi Rhesus mediante colorazione con peptide-MHC-I tetramero. J. Vis. Exp. (2016)

Questo video mostra un metodo per caratterizzare le cellule T di memoria CD8⁺ specifiche per il virus dell'immunodeficienza delle scimmie (SIV) utilizzando tetrameri del complesso di istocompatibilità maggiore peptidico di classe I (pMHC-I). Un tetramero pMHC-I è un complesso di quattro molecole MHC-I legate a peptidi specifici per SIV e coniugate a un fluoroforo. Questi tetrameri si legano selettivamente ai recettori delle cellule T (TCR) sulle cellule T CD8⁺ specifiche per SIV, facilitando la caratterizzazione di queste cellule.

Protocollo

1. Trattamento PKI

NOTA: Questo è opzionale, ma consigliato per i tetrameri Mamu-B*017:01.

1. Risospendere PBMC in terreno R10 a una concentrazione di 1,6 x 10⁷ cellule/ml.
2. Aggiungere 50 μl di questa sospensione cellulare alle provette per citometria a flusso corrispondenti. Aggiungere 50 μl di una soluzione di PKI da 100 nM a ciascuna provetta.
3. Agitare ogni tubo. Incubare a 37 °C per 30 min. Al termine di questa fase, ogni provetta dovrebbe avere 100 μl di una sospensione cellulare contenente 8,0 x 10⁵ PBMC e 50 nM di PKI.
4. Procedere alla fase di colorazione del tetramero pMHC-I.

2. Colorazione con tetrameri pMHC-I marcati con fluorocromo

1. Prima di preparare la miscela master per tetramero pMHC-I, centrifugare le provette per tetramero pMHC-I a 20.000 x g per almeno 15 minuti a 4 °C. L'obiettivo di questa fase è quello di pellettare aggregati proteici nella soluzione di tetramero pMHC-I che può aumentare la colorazione di fondo. Una volta terminata la fase di centrifugazione, evitare di pipettare dal fondo della provetta dove si saranno accumulati gli aggregati proteici.
2. Preparare una quantità sufficiente di miscela master di tetramero pMHC-I per colorare tutte le provette sperimentali. Preparare un eccesso del 15% del volume totale di questa miscela master per tenere conto degli errori di pipettaggio.
3. Diluire i tetrameri pMHC-I in tampone colorante (ad es. Brilliant Stain Buffer) in modo da aggiungere a ciascun test 25 μl della miscela master del tetramero pMHC-I.
   1. Etichettare la PBMC con due tetrameri pMHC-I per test; uno coniugato alloficocianina (APC) e l'altro a Brilliant Violet (BV) 421.
4. Aggiungere 8,0 x 10⁵ PBMC alle provette per citometria a flusso corrispondenti in un volume finale di 100 μl. Se le cellule sono state sottoposte al trattamento PKI sopra descritto, dovrebbero già essere risospese in 100 μl in questa fase.
5. Aggiungere 25 μl di miscela master di tetramero pMHC-I alle provette per citometria a flusso corrispondenti. Alla fine di questa fase, il volume finale in ciascuna provetta dovrebbe essere di 125 μl.
6. Agitare ogni tubo per omogeneizzare la sospensione cellulare.
7. Incubare al buio a temperatura ambiente per 45 minuti. Preparare il cocktail di anticorpi monoclonali (mAb) con colorazione superficiale durante questa incubazione di 45 minuti.

3. Colorazione superficiale

1. Preparare una quantità sufficiente di mAb master mix per colorare tutte le provette sperimentali. Preparare un eccesso del 15% del volume totale di questa miscela master per tenere conto degli errori di pipettaggio.
2. Regolare il volume della miscela master con tampone colorante in modo da aggiungere 50 μl per test.
3. Per una corretta esclusione delle cellule T non-CD8⁺ e la delineazione dei sottogruppi di memoria, utilizzare quantità titolate di mAb diretti contro le seguenti molecole nella miscela master di colorazione superficiale.
   nota: I fluorocromi coniugati a ciascun anticorpo monoclonale sono forniti come riferimento: CD14 BV 510, CD16 BV 510, CD20 BV 510, CD8α BV 785, CD28 PE Cy7 e CCR7 FITC. Si noti che gli anticorpi monoclonali contro CD14, CD16 e CD20 sono coniugati allo stesso fluorocromo (cioè BV 510) poiché saranno inclusi nel cancello di "dump".
4. Includere un colorante fissabile per discriminare le cellule morte nella miscela master di colorazione superficiale [cioè colorante reattivo all'ammina (ARD)]. Assicurarsi che il reagente ARD sia coniugato a un fluorocromo con uno spettro di emissione simile a quello utilizzato nel cancello di "scarico". In questo caso, utilizzare ARD Aqua.
5. Aggiungere 50 μl della miscela master di colorazione descritta ai punti 3.1-3.4 alle provette per citometria a flusso corrispondenti. Alla fine di questa fase, il volume finale in ciascuna provetta dovrebbe essere di 175 μl.
6. Agitare ogni tubo. Incubare al buio a temperatura ambiente per 25 minuti.
7. Celle di lavaggio con tampone di lavaggio (soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente lo 0,1% di albumina sierica bovina e 0,45 g/L di NaN3).
   cautela: L'azide di sodio (NaN₃) è una sostanza tossica. L'esposizione a quantità anche minime può causare sintomi. Maneggiare questa sostanza secondo le linee guida specificate dall'Ufficio per la salute e la sicurezza ambientale (EHS) presso l'istituto in cui vengono eseguiti questi esperimenti.
8. Centrifugare le provette a 510 x g per 5 minuti. Decantare con cura il surnatante in un contenitore per rifiuti separato. Assicurati di non disturbare il pellet.
   cautela: Non travasare il surnatante del tampone di lavaggio in serbatoi contenenti candeggina poiché può reagire con l'azide di sodio presente nel tampone di lavaggio e provocare la formazione di un gas tossico. Contattare l'ufficio EHS presso l'istituto in cui vengono eseguiti questi esperimenti per le linee guida su come smaltire l'azoturo di sodio.
9. Dopo la decantazione, agitare le cellule nel liquido rimanente trattenuto in ciascuna provetta.

4. Fissazione delle celle

1. Aggiungere 250 μl di una soluzione di paraformaldeide (PFA) al 2% a tutte le provette per fissare le cellule.
   ATTENZIONE: Il PFA è una sostanza tossica. L'esposizione a quantità anche minime può causare sintomi. Maneggiare questa sostanza secondo le linee guida specificate dall'Ufficio EHS presso l'istituto in cui vengono eseguiti questi esperimenti.
   1. Poiché la soluzione di PFA al 2% deve essere isotonica alle cellule, utilizzare il PBS per preparare questa soluzione. Cento millilitri di una soluzione di PFA al 2% sono sufficienti per più esperimenti. Agitare accuratamente tutte le provette subito dopo l'aggiunta del 2% di PFA per prevenire la formazione di aggregati cellulari.
2. Incubare al buio a 4 °C per 20 min.
3. Lavare le celle ripetendo i passaggi 3.7-3.9. Una volta completato questo passaggio, le celle possono essere conservate al buio a 4 °C per 24-48 ore. Prima di procedere alla fase di permeabilizzazione, agitare accuratamente i tubi.

5. Permeabilizzazione delle cellule

1. Aggiungere 500 μl di tampone di permeabilizzazione. Vortice tutti i tubi.
2. Incubare al buio a temperatura ambiente per 10 minuti.
3. Lavare le celle ripetendo i passaggi 3.7-3.9.

6. Colorazione intracellulare

1. Preparare una quantità sufficiente di mAb master mix per colorare tutte le provette sperimentali.
2. Regolare il volume con PBS o colorante in modo da aggiungere 50 μl della miscela master intracellulare di mAb per test.
3. Preparare la master mix di mAb descritta nei punti 6.1 e 6.2 utilizzando quantità titolate di mAb diretti contro CD3 e granzima B (Gzm B).
   nota: L'impegno del TCR da parte dei tetrameri pMHC-I può provocare l'internalizzazione del CD3, che può interferire con il rilevamento di tetrameri + cellule T CD3⁺ CD8⁺ se il mAb anti-CD3 viene aggiunto alla miscela master di colorazione superficiale. Per evitare ciò, aggiungere l'anticorpo monoclonale anti-CD3 in questa fase, cioè dopo che le cellule sono state permeabilizzate. I fluorocromi coniugati a ciascun mAb sono elencati come riferimento: CD3 PerCP Cy5.5 e Gzm B PE.
4. Aggiungere 50 μl di cocktail di mAb alle provette corrispondenti. Incubare al buio a temperatura ambiente per 30 min.
5. Lavare le celle ripetendo i passaggi 3.7-3.9. Le provette sono pronte per essere acquisite in un citometro a flusso.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Dasatinib	Assone medchem	Axon 1392	Deve essere risospeso in DMSO e immediatamente conservato a -20°C
RPMI con Glutamax	gibco/ Tecnologie per la vita	Codice 61870-036	Deve essere conservato a 4 °C
FBS inattivato a caldo	gibco/ Tecnologie per la vita	Codice 10082-147	Deve essere conservato a 4 °C
Penicillina-Streptomicina-Amfotericina B	Lonza	17-745E	Deve essere conservato a 4 °C
DMSO, anidro	Tecnologie per la vita	D12345	Conservare a temperatura ambiente.
Provette in polipropilene a fondo tondo da 5 mL	VWR	Codice 60819-728
Tetrameri pMHC-I coniugati con fluorocromo	NIH Tetramer Core o MBL, Inc.		Deve essere conservato e mantenuto a 4 °C. Centrifugare a 20.000 x g per 15 minuti prima dell'uso. Non congelare.
Corpi monoclonali coniugati con fluorocromo	Aziende varie		Deve essere conservato e mantenuto a 4 °C. Non congelare.
LIVE/DEAD Kit di colorazione per cellule morte Aqua riparabile	Tecnologie per la vita	L34957	Deve essere conservato a -20 °C. Risospendere ciascuna aliquota in 50 μl di DMSO prima dell'uso.
Brilliant Stain Buffer	BD Bioscienze	563794	Deve essere conservato a 4 °C
Soluzione salina tamponata con fosfato	VWR	Codice 97064-158	Conservare a temperatura ambiente
Albumina Bovina	VWR	Codice: 700011-230	Deve essere conservato a 4 °C
Aziduro di sodio	VWR	Codice 97064-646	Conservare a temperatura ambiente. Sostanza tossica. Non mescolare con candeggina.
candeggiare	VWR	89501-620	Sostanza chimica corrosiva, non può essere miscelata con azoturo di sodio. Maneggiare con cura
Paraformaldeide	Scienze della microscopia elettronica	15714-S	Reagente infiammabile, corrosivo e tossico. Maneggiare con cura
Polisorbato 20 (Tween-20)	Alfa Aesar	L15029	Conservare a temperatura ambiente
Soluzione di permeabilizzazione 2	BD Bioscienze	340973	Reagente tossico e corrosivo. Maneggiare con cura
Provette Sarsdet 1,5 ml tappo a vite	VWR	72.692.005
Provette a basso legame da 2,0 ml di DNA/RNA	Eppendorf	22431048	L'uso di microprovette sterili è preferibile
Miscelatore a vortice
Armadio di biosicurezza
Sistema di purificazione dell'acqua intergral Milli Q	EMD Millipore	ZRXQ010WW	Può essere utilizzata acqua di biologia molecolare di qualsiasi fornitore
Microcentrifuga
centrifuga
Frigorifero a 4 °C
BD LSR II	BD Bioscienze		citometro a flusso deve contenere laser e filtri compatibili con il pannello di colorazione utilizzato.
Acqua deionizzata
Alluminio	VWR SCIENTIFIC INC.	Codice 89068-738
incubatrice			Deve essere in grado di mantenere una temperatura interna di 37 °C
Software FACS Diva	BD Bioscienze
Software Flowjo versione 9.6	Flowjo		Utilizzato per analizzare i file FCS generati dal software FACS Diva
Punte per micropippette